茶树菇(Cyclocybe aegerita)属于假脐菇科(Tubariaceae)环伞属(Cyclocybe)^[1]，分布于我国江西、福建、云南、浙江及四川等地。因其生长宿主的多样性及形态上的细微差别，又被称为杨树菇、柳松茸、柳环菌^[2]。茶树菇是高蛋白、低脂肪、低糖分且集营养、保健和食疗于一体的珍稀食用菌。江西省茶树菇产量为全国第一^[3]，种植规模较大。交配型研究是茶树菇野生菌种驯化和品种选育的基础。茶树菇的交配系统属于四极性异宗结合^[4]，双核体菌丝中存在两种交配型，具有异宗结合食用菌的基本遗传特征。潘迎捷等^[5]通过研究6种异宗结合食用菌的原生质体单核化现象和单核原生质体的遗传规律，发现单核原生质体中保留了亲本中的两种交配型AxBx和AyBy，未出现亲本双核体在减数分裂阶段通过基因重组形成的其他两种新交配型AxBy和AyBx，亲本交配型这一遗传性状在单核原生质体再生菌丝中是稳定的。真菌原生质体技术的研究至今已有60多年的历史，原生质体技术可应用于食用菌交配型鉴定^[5]、细胞质遗传^[6]及基因型遗传规律的研究^[7]等。因此，深入开展食用菌原生质体技术的研究仍具有重要的理论意义和应用价值。

茶树菇遗传育种工作是茶树菇产业持续发展的保障和关键，原生质体的制备及单核体菌株的获得可为茶树菇遗传育种工作的开展提供技术支持。自1972年荷兰研究人员首次采用裂解酶获得裂褶菌(Schizophyllum commune)原生质体^[8]后，目前已有超过70种食用菌成功地制备了原生质体^[9]，原生质体技术已广泛应用于食用菌的研究^[10]。在茶树菇原生质体制备和利用方面，邱敦莲等^[11]通过原生质体的分离和再生筛选到一株茶树菇单核体菌株；张渊等^[12-13]通过原生质体紫外诱变选育了茶树菇新菌株；江力等^[14-15]通过原生质体制备研究了茶树菇原生质体的融合、茶树菇与鸡腿菇原生质体的融合及再生。目前尚未见研究茶树菇单核体菌株特性及交配型的完整文献报道。因此，本文采用在铺有玻璃纸的平板上培养菌丝的方法制备茶树菇原生质体^[16]，从接种块数量、酶解温度和酶解时间三方面对茶树菇原生质体制备过程进行优化，并对茶树菇原生质体的再生特性、单核化特性及其交配型进行研究，以期为开展茶树菇的杂交育种、融合育种、诱变育种、遗传转化和功能基因挖掘等奠定基础。

1 材料与方法 1.1 材料

1.1.1 供试菌株

茶树菇C. aegerita菌株‘Aa11’由江西省农业科学院农业应用微生物研究所食用菌育种室提供。

1.1.2 培养基

(1) PDA培养基：马铃薯200.0 g，葡萄糖20.0 g，琼脂20.0 g，水1 000 mL。(2) PDMS再生培养基：马铃薯200.00 g，葡萄糖20.00 g，琼脂20.00 g，蔗糖205.38 g，麦芽糖1.00 g，定容至1 000 mL。

1.1.3 主要试剂

(1) 0.6 mol/L甘露醇：称取甘露醇10.93 g，用双蒸水溶解定容至100 mL，1×10⁵ Pa灭菌20 min备用。(2) 1.5%溶壁酶：称取溶壁酶0.09 g，用6 mL 0.6 mol/L的甘露醇溶解，0.45 μm滤膜过滤除菌。

1.2 方法

1.2.1 原生质体的制备

采用李良敏等^[16]的方法制备茶树菇原生质体，使用的平板菌丝如图 1所示，即在铺有玻璃纸的平板上接种7个茶树菇菌丝块，待菌落的菌丝相互接触时，直接在玻璃纸上对菌丝进行酶解(图 2)。

1.2.2 接种块数量对原生质体制备的影响

分别在平板上接种3、5、7、10个茶树菇菌丝块，接种1个菌丝块的平板作为对照，待不同菌落的菌丝相互接触时(图 3)，记录各平板的培养时间，原生质体制备其他步骤参照1.2.1。

1.2.3 酶解温度和酶解时间对原生质体得率的影响

制备原生质体使用接种7个茶树菇菌丝块的平板，酶解温度分别设置为30、32、34和36 ℃这4个温度梯度，酶解时间分别设置为30、60、120和180 min这4个时间梯度。

1.2.4 原生质体的再生

采用张美彦等^{[7, 17]}的方法进行原生质体的再生培养，并计算原生质体再生率和原生质体单核率。原生质体再生率=分离获得的再生菌株数量/涂布的原生质体数量；原生质体单核率=单核菌株数量/再生菌株数量。

1.2.5 交配型鉴定

采用张美彦等^[17]和谭琦^[18]的方法进行交配型鉴定实验，同时每天观察对峙培养亲本单核菌丝体的菌落形态变化。

1.3 统计分析

用Excel 2007进行统计分析，并以SPSS 22.0进行方差分析，使用OriginPro 8进行图表制作。

2 结果与分析 2.1 不同接种块数量下的菌丝培养时间和原生质体得率

接种块数量为7时制备的原生质体得率最高。如表 1所示，接种块数量由1增加至3和5时，菌丝培养时间均显著缩短，从280 h减少至136 h和112 h，原生质体的得率未显著增加；接种块数量由5增加至7时，菌丝培养时间未显著缩短，但原生质体得率则显著增加，增加了13倍；当接种块数量增加至10时，原生质体得率又下降，也表现出显著差异。

2.2 不同酶解温度下的原生质体数量

如图 4所示，酶解温度为30 ℃时茶树菇原生质体数量为1.86×10⁷个/mL；酶解温度为32 ℃时原生质体数量显著上升，为4.98×10⁷个/mL；酶解温度为34 ℃时原生质体数量达到最大值，为6.75×10⁷个/mL；酶解温度为36 ℃时原生质体数量显著下降，原生质体数量下降至10⁶个/mL水平。从曲线的走向可知，最佳的酶解温度为33−34 ℃。

2.3 不同酶解时间下的原生质体数量

如图 5所示，酶解时间为30 min时，茶树菇原生质体数量为1.33×10⁷个/mL；酶解时间为60 min时，原生质体数量达到最大值，为3.46×10⁷个/mL；酶解时间延长至120、180 min，原生质体数量显著下降，120 min酶解后仍能维持在含有1.62×10⁷个/mL；酶解时间为180 min时，原生质体数量不足10⁷个/mL。从曲线的走向可知，最佳的酶解时间为60−80 min。

结合2.1、2.2的结果可知，在制备茶树菇原生质体时，当接种块数量为7、酶解温度在33−34 ℃、酶解时间为60−80 min时，可以获得较多原生质体。

2.4 原生质体再生特性

茶树菇单个平板制备的原生质体浓度为6.7×10⁶个/mL，将原生质体悬液梯度稀释后涂布至再生培养基表面，经25 ℃恒温培养，至第7天时肉眼即可见到有再生菌落形成，第10−11天可以看到清楚的白色菌落。图 6和图 7分别为制备的茶树菇原生质体及其再生菌落。继续培养至不再有菌落出现为止，统计再生菌落数，结果表明，菌株Aa11的再生率达0.71%。

培养皿中的原生质体再生菌落的生长状况有较大的差异，异核体再生菌落大，菌丝纹路清晰，呈发散状，生长较快(图 8A)；单核体再生菌落小，呈绒球状，菌丝均质、细密，不向外发散，生长较慢，各单核体菌株的菌落形态无较大差异(图 8B)。显微镜观察结果与蔡衍山等^[4]报道的结果一致，即异核菌丝略粗，粗细较均匀，有锁状联合(图 9A)；单核菌丝较细，粗细较不均匀，无锁状联合(图 9B)。

2.5 原生质体单核化特性

2.5.1 单核化率

从培养皿中出现再生菌落开始，即通过镜检来判断再生菌落的单双核情况，结果表明，第7天时再生菌落开始出现；第7−10天再生菌落几乎均为异核体菌株；第11天开始陆续出现单核体菌落，持续时间有15 d之久，直到不再有单核体菌落出现。第7天和第12天挑取的再生菌落在平板上的生长形态如图 10所示，符合上述对单双核菌落生长形态的描述。试验共挑取再生菌落数705个，其中再生单核体菌落数290个，计算得到单核化率为41.1%。

2.5.2 交配型鉴定及形态观察

菌株Aa11制备得到290个原生质体单核体，经统计交配型为A1B1的单核体有138株，A2B2的单核体有152株。两种交配型的单核体在菌落形态上无明显差异，都表现为气生菌丝旺盛，颜色浓白，A1B1单核体的生长速度要快于A2B2单核体(图 11)。

2.5.3 单核菌丝体对峙培养过程中菌落形态的变化

在单核菌丝体对峙培养过程中，随着培养时间的增加，2个亲本菌落不断扩大，对峙培养成功的2个亲本菌落会在接触区域形成一条明显比周围菌丝体稀薄的分界线(图 12A−12D)，而对峙培养不成功的2个亲本菌落不会形成一条这样的分界线，并且2个亲本菌落会慢慢融合成一个大的菌落(图 12E和12F)。亲本菌落的生长速度决定了双亲菌落接触区域分界线的弯曲方向和双亲菌落铺满整个培养皿的时间，A1B1交配型亲本菌落的生长速度要大于A2B2交配型亲本；在对峙培养成功的每个培养皿中，双亲菌落接触区域的分界线均向菌落生长速度小的亲本菌落弯曲(图 12B−12D)。由于2个亲本的菌落生长速度都较小，在接触16 d时菌落才铺满整个培养皿，因此，对峙培养成功的2个亲本单核菌丝体采集了接触16 d的菌落(图 12D)。在铺满整个培养皿时，菌落生长速度快的亲本菌落有包围速度小的亲本菌落的趋势(图 12B−12D)，对峙培养成功的2个亲本菌落接触区域的菌丝会形成锁状联合(图 12G)。

3 讨论与结论

本研究通过采用在铺有玻璃纸的平板上培养菌丝的方法制备了茶树菇原生质体，即在铺有玻璃纸的PDA平板(直径90 mm)上接种7个茶树菇菌丝块(直径4 mm)，培养4 d后将带有菌丝体的玻璃纸转移到另一个无菌培养皿中，直接在菌丝上滴加3 mL的1.5% (质量体积分数)溶壁酶溶液酶解60 min，单个平板制备的原生质体数量为10⁶−10⁷个。该方法与常用的液体培养的菌丝制备原生质体的方法相比具有制备时间短、操作简单和不易污染的优点。

原生质体的再生率是原生质体应用的重要前提，许多条件如菌丝培养阶段的菌龄、培养基成分和培养方式，以及酶解阶段的细胞壁降解酶种类、酶的浓度、酶解时间、酶解温度、酶解液pH、渗透压稳定剂的性质及浓度、预处理方式和再生培养基种类等均影响原生质体得率和再生率^{[16, 19]}。本实验研究了接种块数量、酶解温度和酶解时间对茶树菇原生质体得率的影响，发现在接种块数量为7、酶解温度为33−34 ℃、酶解时间为60−80 min时可获得较多原生质体，这与李良敏等^[16]对香菇和金针菇的研究结果和王杰等^[20]对草菇的研究结果一致。

根据以往研究报道，食用菌原生质体再生时，单核体的菌株出现晚、菌落小、菌丝细弱、菌丝生长速度小，而异核体的菌株出现早、菌落大、菌丝旺盛、菌丝生长速度大^{[5, 19, 21]}。本研究结果显示，茶树菇也基本符合这一规律，只是单核体菌丝旺盛、颜色浓白，双亲对峙培养后菌落接触部位存在一条明显比周围菌丝体稀疏的分界线，而且此分界线会向菌落扩大速度慢的亲本菌落弯曲，与宋晓霞等^[22]对香菇单单杂交过程中的菌落形态变化描述一致。

本研究原生质体分离的单核体中生长速度小的单核体菌株集中在一种交配型中，说明存在一个与交配因子连锁的生长相关基因，这在平菇^[23]和杨柳田头菇^[24-25]中也得到了证实。大型真菌菌丝生长速度为多基因控制的数量性状(quantitative trait loci，QTL)^[26]，其涉及酶类、激素分泌和耐温特性等^[27-28]，交配因子不可能与这么多的基因连锁，而且目前的研究已证明交配因子A和B本身并不连锁且存在于不同的染色体上^{[25, 29]}，那么与交配因子连锁的速度生长基因应是调控底物利用相关的酶类和细胞分裂的调控元件，周会明等^[30]根据单孢分离重组的结果分析得出，调控元件应该与B因子的其中一个亚基连锁，香菇原生质体去双核化的结果也表明B因子影响核活力^[31]。

通过对茶树菇原生质体的再生特性、单核化特性及其交配型的研究，可为开展茶树菇的杂交育种、融合育种、诱变育种、遗传转化和功能基因挖掘等奠定基础，促进茶树菇产业的持续稳定发展。