自20世纪40年代起，抗生素成为临床上最普遍应用的药物。然而抗生素的大量使用及滥用，加速了耐药菌的产生。细菌耐药性问题日趋严重^[1]，同时，抗生素类药物研发周期漫长的现况，已经严重威胁到人类的健康，因此，研究与开发新型抗菌产品已迫在眉睫。2020年7月1日起，我国全面禁止在饲料端添加促生长类抗生素，养殖端“限抗、减抗”，以期实现全球的最终目标“2027年畜禽类绝对的无抗养殖”。随着后抗生素时代的到来，噬菌体治疗又重新受到重视^[2]。噬菌体是一种“吃”细菌的纳米级微生物，与抗生素相比，噬菌体的突出优势在于^[3-4]：(1) 可以在细菌感染部位自我复制增殖，靶向杀灭致病菌；(2) 其具有种属特异性，专一性裂解目标菌，不会引起机体微生态失衡；(3) 噬菌体在自然界和动物体中广泛存在，无毒副作用、无残留；(4) 噬菌体制剂的研制时间和成本远远低于新型抗生素药物的研发周期和成本，噬菌体是最有潜力的抗生素替代品之一。

美国食品和药物管理局(Food and Drug Administration，FDA)和美国农业部(United States Department of Agriculture，USDA)已经批准了几种基于噬菌体的制剂，旨在克服最常见的病原菌污染，如大肠杆菌(Escherichia coli)、沙门氏菌(Salmonella)、弯曲菌(Campylobacter)和李斯特菌(Listeria)。噬菌体制剂可作为即食食品(ready-to-eat，RTE)和肉类生产中的添加剂，用于杀灭屠宰前的动物或动物饲料中的致病菌^[5-7]。在人类和动物体中使用噬菌体，需要口服噬菌体制剂或局部给药^[8]。然而，噬菌体作为一种具有蛋白质外壳的活微生物^[9]，易受蛋白质变性因子的影响^[10]。因此，噬菌体在使用过程中面临诸多挑战。例如，在运输和储藏过程中，噬菌体对“冷链”依赖极高，通常需要在2−8 ℃的低温下储存，而且口服噬菌体在动物体胃肠道内易被胃酸、消化酶(胃蛋白酶、蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶和胰蛋白酶)、胆汁酸盐、胰液等破坏^[11-12]，丧失杀菌活性，难以发挥有效肠道抗菌及调节肠道微生态的功能^[13]。此外，在食品加工过程中，低温、高温或接触化学试剂均可损害噬菌体活性^[14-16]。将噬菌体封装到保护性微囊或者纳米颗粒中制备成固态噬菌体制剂是一种行之有效的方法，以克服不利的储存、胃肠生理和食品加工环境，延长保质期、提高其运输和储存过程的易操作性，增加噬菌体的生物药效，同时，将噬菌体定向输送至感染部位(例如肺部、肠道)，提高其控制致病菌的能力^[14-16]。

赋形剂的种类、配方及包被技术是制备长效固态噬菌体制剂及发挥高效生物有效性的关键步骤。目前，常用于噬菌体包被的赋形剂有食品级聚合物、脂质体和pH响应性高分子材料，如聚乳酸-羟基乙酸共聚[poly(lactic-co-glycolic acid)，PLGA]，尤特奇(Eudragit^®)、聚乙烯醇^{[15, 17-18]}。不同赋形剂对噬菌体的抗逆性及长期活性稳定性的保护效率是不同的，本文综述了目前用于包被噬菌体的赋形剂种类、配方、包被技术及储存稳定性，为噬菌体制剂的优化设计提供了研究基础。

常用的食品级聚合物有海藻酸钠、壳聚糖、卡拉胶、乳清蛋白、明胶、果胶、酪蛋白等。以海藻酸钠为基础，加入不同的赋形剂材料，通过挤压法制成噬菌体水凝胶或者通过喷雾干燥法制成噬菌体粉末，这些包被材料与技术是制备具有抗逆性和储存稳定的噬菌体制剂的有效手段^{[15, 17-18]}。

海藻酸钠是一种阴离子线性多糖，其分子由β-D-甘露糖醛酸(β-D-mannuronic，M)和α-L-古洛糖醛酸(α-L-guluronic，G)按(1→4)键连接而成^[19]。海藻酸钠水凝胶是最常见、最简单的赋形剂，其被广泛应用于包被各种形态的噬菌体^[20-27]。这种海藻酸钠水凝胶是通过挤压法将噬菌体和海藻酸钠混合成的亲水胶体以液滴形式加入氯化钙溶液，此时古洛糖醛酸的羧酸盐阴离子和钙离子发生交联，形成“egg-box”^[28]。尽管海藻酸钠水凝胶为噬菌体提供了基本的酸性保护，但是海藻酸钠水凝胶在非凝胶阳离子(如Na⁺和Mg²⁺)存在的情况下不稳定，并且其凝胶孔隙容易被酸渗透，导致其抗逆结构性能较差。为了克服这一缺陷，常用的方法是在海藻酸钠水凝胶中加入各种聚合物，例如壳聚糖、乳清蛋白、酪蛋白、卡拉胶、海藻糖、蔗糖等，以增强凝胶结构的强度。研究表明，海藻酸钠-壳聚糖包裹的噬菌体微囊可一定程度提高酸性条件下噬菌体制剂的稳定性。Ma等^[20]将噬菌体Felix O1包被在海藻酸钠-壳聚糖微囊中，可完全保护噬菌体免受胆盐的影响。然而，在pH 2.0的模拟胃液(simulated gastric fluid，SGF)中，凝胶对噬菌体只有部分保护作用，并且在pH 6.8的模拟肠液(simulated intestinal fluid，SIF)中，微囊化噬菌体的释放时间较慢，完全释放需要5 h。除此之外，El Haddad等^[21]研究表明，海藻酸钠凝胶的粒径大小会影响噬菌体包被率，其中肌病毒科噬菌体Team1在2 mm (大微球)中的包被率高于0.5 mm (小微球)。为了保护噬菌体免受胃酸的影响，在海藻酸钠凝胶中加入CaCO₃，发现包被后的噬菌体对SGF的耐酸性增强；然而，在SIF中释放率没有改善^[22-24]。这是由于CaCO₃的加入发挥了一种缓冲作用，防止氢离子渗透到微胶囊内部，同时溶解的钙离子也可能与海藻酸分子上的羧基相互作用，从而进一步增强SGF中的钙-海藻酸凝胶网络。当培养基从SGF变为SIF时，从CaCO₃解离的游离Ca²⁺仍然存在于凝胶网络中，会抑制海藻酸钠凝胶的膨胀，导致其释放速度变慢。为了解决这一问题，Tang等^[25]将乳清蛋白(一种廉价奶酪的副产品)与海藻酸钠凝胶进行结合来封装噬菌体Felix O1。由于乳清蛋白水凝胶在pH值高于其等电点(pI 5.1)时容易膨胀，并可被SIF中的胰酶降解，因此添加乳清蛋白将显著加速噬菌体微球释放到SIF中。同时，由于变性乳清蛋白具有大量的疏水表面，可以阻止酸与噬菌体的直接接触，并且在pH 2.0的SGF中，封装的噬菌体可存活长达2 h。Tang等^[26]再次证实乳清蛋白-海藻酸钠微胶囊对噬菌体K具有良好的保护性和释放性，这表明海藻酸盐/乳清蛋白组合可以成为各种形态噬菌体口服给药的潜在候选配方。Abdelsattar等^[27]将大肠杆菌噬菌体ZSEC5的壳聚糖-海藻酸钠凝胶外层再用蜂蜜和明胶进一步包被，发现噬菌体凝胶在水中形态完整，但在37 ℃ SIF中4−5 h溶解后可完全释放出噬菌体。Silva Batalha等^[29]首次使用海藻酸钠-卡拉胶包被噬菌体，研究表明，海藻酸钠水凝胶包被的噬菌体UFV-AREG1对脱水敏感，需要加入保护剂保护其活性稳定。Kim等^[30]将麦芽糖(双糖)等添加到配方中，防止微囊干燥过程中噬菌体活性损失，以提高微囊化噬菌体储存稳定性。

海藻酸钠配方不仅可以用来制备水凝胶保护噬菌体，而且可以作为冷冻干燥或者喷雾干燥的赋形剂保护噬菌体。Petsong等^[14]通过冷冻干燥法将乳清蛋白和海藻糖以3:1 (质量比)包被的噬菌体制备成粉剂，包被率最高达91.9%；包被噬菌体粉剂在pH值为1.5、3.5、5.5、7.5和9.5的环境中5 h后的存活力均  >  90%；此外，在10 ℃和30 ℃下，包被噬菌体粉剂可以有效杀灭肠炎沙门氏菌(Salmonella Enteritidis)和鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella Typhimurium)。Acar Soykut等^[11]使用1.33% (质量体积分数)海藻酸钠包被不同种类的噬菌体并进行喷雾干燥发现，制备的噬菌体粉剂提高了噬菌体耐胃酸和胆盐的能力；在SGF中2 h后，枯草芽孢杆菌噬菌体(Bacillus subtilis phage)、肠炎沙门氏菌噬菌体(Salmonella Enteritidis phage)、鼠伤寒沙门氏菌噬菌体(Salmonella Typhimurium phage)效价分别下降0.60 lg、2.29 lg、1.71 lg，而游离噬菌体在SGF中仅能存活15 min。

脂质体是由脂质双层包围的球形纳米颗粒，具有高度生物相容性，是一种定向药物载体。利用脂质体包被噬菌体方法，又称为“特洛伊木马”法^[31]，该方法可以提高噬菌体的抗逆性，延长其储存期，改变被包被噬菌体在动物体内的分布。由于阳离子脂质体与带负电荷细菌的相互作用^[32]，脂质体包裹的噬菌体可以黏附并扩散到含有致病菌的病灶部位或者黏膜内，并且延长噬菌体在感染部位的滞留时间，从而提高噬菌体治疗指数，尤其适用于呼吸道、局部伤口和胃肠道感染^[33-39]。

张劼等^[33]的研究表明，脂质体包被的噬菌体AB3通过滴鼻进入小鼠体内，在肺组织中的存留时间可延长至300 min，与未包被噬菌体相比，第7天产生更低效价的中和抗体，第14天中和抗体效价降为0。Colom等^[34]将噬菌体UAB_Phi20、UAB_Phi78和UAB_Phi87封装在脂质体中，并研究它们在减少禽沙门氏菌方面的功效；包裹的噬菌体脂质体粒径为309−326 nm，带正电荷(+31.6−+35.1 mV)，包被率为47%−49%，在4 ℃下至少可以储存3个月，并可添加到动物饮水和饲料中；研究发现在SGF (pH 2.8)中，未包被噬菌体的效价降低了5.7−7.8 lg，而包被噬菌体的稳定性显著提高，仅降低3.7−5.4 lg。除此之外，脂质体包被也提高了噬菌体在鸡肠道中的滞留率(72 h后，脂质体包被组38.1%，非包被噬菌体9.5%)。同样的，Singla等^[35]开发了一种噬菌体脂质体递送系统，可以确保噬菌体在感染部位的高效递送和感染部位滞留；采用不同比例的胆固醇、脂质和表面活性剂及不同电荷包被噬菌体，结果表明，阳离子脂质体噬菌体的最大包被率为92%；利用透射电镜(transmission electron microscope，TEM)技术证实噬菌体被均匀包被在脂质体中；脂质体包被法可延长噬菌体在动物器官中的保留时间，即在血液中可保留4 d，在肝、肺和肾中可保留6 d，在脾脏中可保留14 d，而在血液和肺中以及在所有其他器官中，第36 h时已未检测到游离噬菌体。Cui等^[36]将壳聚糖膜包被的噬菌体再用脂质体包被，包被率为57.66%±0.12%，此包被法对Escherichia coli O157:H7具有很高的抗菌活性，但对牛肉的感官品质没有影响。因此，通过脂质体/壳聚糖膜包被的噬菌体有望成为牛肉保鲜的抗菌包装材料。Chadha等^[37]在BALB/c小鼠中建立了肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumoniae) B5055烧伤创面感染模型，用脂质体包被的噬菌体鸡尾酒处理小鼠，发现小鼠血液和主要器官中的细菌载量大幅下降；脂质体增加了噬菌体在体内的滞留时间，从而增强了疗效；即使延迟24 h治疗，脂质体噬菌体制剂也能够保护所有试验动物免于死亡。Chhibber等^[38]使用一种脂质体包被2株金黄色葡萄球菌裂解性噬菌体(Staphylococcus aureus phage) MR-5和MR-10，体内外稳定性和噬菌体动态分布结果发现，脂质体包被的噬菌体混合物可使噬菌体在糖尿病引发的伤口部位具有更好的有效性和持久性。Loh等^[39]基于微流控技术，通过脂质体对2种不同大小形态的噬菌体Eshcherichia coli T3短尾病毒科(大小约65 nm)和肌病毒科Staphylococcus aureus phage K (衣壳头部约80 nm，噬菌体尾部约200 nm)进行了封装，平均粒径为100−300 nm，T3噬菌体的包被率为10⁹ PFU/mL，噬菌体K的包被率仅为10⁵ PFU/mL；研究发现Staphylococcus aureus phage K与脂质双层相互作用，导致大量噬菌体结合在脂质体的外部，而不是被包裹在脂质体内部。脂质体外部的噬菌体极易在胃酸中失活，这样仅部分噬菌体被输送到胃肠道下游感染部位。先前发表的关于脂质体包被噬菌体的研究可能高估了有尾噬菌体的包被率。

pH响应性聚合物也为噬菌体包被提供了许多可用的赋形剂材料，包括脂肪族聚酯、聚酰胺、聚碳酸酯和聚氨基酸^[40-42]。其独特的性质是只在特定的pH值下溶解，并使所需的药物释放在适当的位置或在所需的时间内释放药物。

Eudragit^®是一种pH响应性聚甲基丙烯酸酯聚合物家族，广泛应用于制药行业，已成功用于包被结肠给药的药物^[43]。Eudragit^®L100在pH 6.0时溶解，Eudragit^®S100在pH 7.0时溶解^[44]。这些聚合物可在市场上买到，并广泛用于噬菌体纳米纤维的包被中。在喷雾干燥过程中暴露在高温下会降低噬菌体活性，然而，同时加入pH响应性聚合物和多糖类物质可大大提高噬菌体存活率，并且降低工艺成本，促使大规模工业化生产噬菌体制剂成为可能。Vinner等^[45]用市场上销售的Eudragit^®S100来封装沙门氏菌噬菌体(Salmonella phage) Felix O1，制成口服片剂；在喷雾干燥过程中，如果单纯使用Eudragit^®S100并不能有效保护噬菌体，而在赋形剂中同时添加海藻糖可以有效保护噬菌体免受喷雾干燥过程中的热应力和脱水应力；聚合物配方中海藻糖比例越高，产生的噬菌体滴度越高。Stanford等^[46]使用聚甲基丙烯酸甲酯-甲基丙烯酸共聚物配方及可伸缩膜乳化技术将大肠杆菌噬菌体(Escherichia coli phage)封装在3种不同的pH响应性聚合物配方中，制备了100 μm的微胶囊，在pH 1.5时噬菌体保持活性，而在pH 5.5、6.0和7.0下控制噬菌体释放。

聚乳酸-羟基乙酸共聚物(polylactic-co- glycolic acid，PLGA)也是一种pH响应性聚合物家族，由聚乳酸(poly-lactic acid，PLA)和聚乙醇酸(poly-glycolic acid，PGA)组成，具有良好的生物相容性和生物可降解性，其已被广泛用于输送小分子、蛋白质和核酸，目前，也有研究将其用于包被噬菌体^[47]。Puapermpoonsiri等^[48]通过改进的水包油包水(water/oil/water，w/o/w)双乳液溶剂萃取方案将2株噬菌体封装到PLGA (PGA: PLA为50:50)中，但是，7 d后包被噬菌体丧失活性，这提示在使用该材料包被噬菌体时需要预防有机试剂引起的噬菌体蛋白变性，但这项工作证明了PLGA作为噬菌体包被的配方和控制释放的概念。在另一项研究中，Agarwal等^[49]通过加入多孔碳酸氢铵优化了PLGA配方，增大噬菌体吸附到PLGA的表面积，并且含乳糖的噬菌体负载颗粒在室温下储存16 d效价无损失；当然，也可用超临界CO₂、或典型的亲水性和冷冻保护剂代替有机溶剂来延长PLGA包被噬菌体制剂的保质期；在应用此类赋形剂过程中，噬菌体与聚合物接触的相互作用方式和方向是保持噬菌体活性的关键；这项工作为噬菌体的靶向治疗和控制释放开辟了道路，有助于噬菌体治疗更广泛地临床应用。

除上述类别外，还有其他赋形剂在噬菌体包被配方中发挥特殊功能。除此之外，研究人员对表面活性剂也进行了研究。Chang等^[50]实验证明普鲁尼克F68 (pluronic F68)对干粉制剂中3种受试噬菌体的稳定性影响不大。类似地，Matinkhoo等^[51]在海藻糖/亮氨酸赋形剂中添加pluronic F68时，发现其不影响噬菌体的稳定性。在该研究中，另一种表面活性剂泰洛沙泊(tyloxapol)在加入海藻糖/亮氨酸制剂时导致噬菌体效价降低。然而，表面活性剂在噬菌体制剂稳定性中的作用机制，还须进一步研究。

目前，只有少数研究将盐作为赋形剂添加到噬菌体固体制剂中。Dini等^[52]研究发现，添加磷酸盐缓冲液不仅不能提高冷冻干燥法以脱脂乳、海藻糖或蔗糖为赋形剂包被的噬菌体的稳定性，而且还会损害蔗糖制剂中噬菌体的储存稳定性；与之相反，噬菌体保存液(SM缓冲液)可以提高冷冻干燥产生的噬菌体的稳定性。

酪蛋白是乳蛋白的主要蛋白质，约占总蛋白量的80%。酪蛋白是典型的含磷蛋白，不是单一蛋白质，而是由α-酪蛋白、β-酪蛋白和κ-酪蛋白组成，在体内外均有广泛应用。Matinkhoo等^[51]的研究表明，在海藻糖和亮氨酸作为赋形剂的喷雾干燥产生的肌病毒科噬菌体制剂中加入2%的酪蛋白钠盐，可将噬菌体效价提高5倍。

选取有效的赋形剂进行冻干噬菌体，也是噬菌体应用和长期储存的有效手段。Manohar等^[53]使用6种不同的赋形剂：葡萄糖、蔗糖、明胶、甘露醇、聚乙二醇和山梨醇对3种裂解性噬菌体——大肠杆菌噬菌体ECP311、克雷伯菌噬菌体KPP235和肠杆菌噬菌体ELP140进行冷冻干燥；结果表明，使用蔗糖、明胶及其组合有利于保持冻干后噬菌体的活力；当冻干噬菌体在4 ℃下储存时，可保持20个月活性不降，但在37 ℃下，10个月后活性降低。

噬菌体在抗生素耐药性细菌感染的治疗中作为防治手段确实有很大的潜力；但是噬菌体疗法如何有效地应用到临床实践中，仍然存在一些局限性。最关键的问题之一是如何保持临床应用与储存过程中的噬菌体活性。本文阐述了噬菌体制剂使用的各类包被赋形剂的种类、配方及包被技术等，并总结了它们在加工和长期储存期间对噬菌体稳定和活性的影响。

寻找合适的噬菌体赋形剂，可参照疫苗或者益生菌的包被配方，或使用高通量统计分析方法和先进的分析工具，如核磁共振和冷冻电镜，用更智能、简化的方法来筛选多种赋形剂、配方及封装方法。在噬菌体制剂和包被领域迫切需要进一步的研究，以确保所选用的赋形剂、配方和加工条件适合所选用的噬菌体，以确保制备出高活性、高抗逆性和长期储存稳定性的噬菌体。