木霉菌作为一种重要的生防功能菌，在植物病害的生物防治中占非常重要的地位。据统计，全球90%的真菌生物防治剂来源于不同菌株的木霉，60%以上的真菌生物杀菌剂含有木霉^[1]。对木霉菌从基因水平上进行功能研究，有助于加快对木霉生防机制的认知。应用DNA遗传转化技术获得突变子是对基因克隆、基因功能研究的重要方法。目前获得突变子的方法有限制性内切酶介导整合技术(restriction enzyme mediated integration，REMI)、CaCl₂-PEG介导转化法、电转化和根癌农杆菌介导转化方法(Agrobacterium tumefaciens mediated transformant，ATMT)等。获得高质量的原生质体是CaCl₂-PEG介导转化法的首要条件，而高质量的原生质体制备困难，操作烦琐且转化效率低^[2]。REMI与PEG介导一样需要制备原生质体，转化率比PEG高但容易造成基因的误译，还存在多位点、串联插入及质粒的重排问题，这阻碍了质粒拯救的克隆途径^[3]。电击转化法是PEG方法的发展，操作简便，但需要专门的电转化仪器，对设备的要求较高^[4-6]。ATMT在理论和技术水平上已经相对完善，是目前应用最广泛的一种木霉菌遗传转化方法。然而影响ATMT成败的因素较多，不同的双元载体、不同的农杆菌菌株类型、共培养的时间、温度、pH等都对转化效率有一定的影响^[7]，操作也很烦琐，因此限制了对木霉基因克隆和基因功能的研究。

深绿木霉(Trichoderma atroviride) HB20111是本实验室筛选获得的一株具有优良生防功能的木霉菌，对多种植物病原真菌如假禾谷镰刀菌(Fusarium pseudograminis)、尖孢镰孢菌(Fusarium oxysporum)、麦根离蠕孢(Bipolaris sorokinianum)和立枯丝核菌(Rhizoctonia solani)等具有抑制作用。实验室前期通过ATMT、REMI及CaCl₂-PEG介导转化法构建了深绿木霉的HB20111遗传转化体系，但转化效率较低，不能满足突变子库构建的需要，为此，本实验采用了一种镁硅酸盐纳米粘土介导转化法，初步建立了深绿木霉HB20111高效遗传转化体系，用于突变子库的构建，以期为进一步深入研究深绿木霉抑菌功能基因奠定基础。

1 材料与方法 1.1 材料

1.1.1 菌株和质粒

深绿木霉(Trichoderma atroviride) HB20111保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心(保藏编号为CGMCC16963)，本实验室保存。丝状真菌载体pCAMBIA1303-gpdA-GFP-TrpC-Hygro购自武汉淼灵生物科技有限公司，该质粒含构巢曲霉TrpC启动子控制的潮霉素抗性基因hph和gpdA启动子控制的绿色荧光蛋白基因gfp。

1.1.2 主要试剂和仪器

潮霉素B，Roche公司；DNA分子量标准、Taq DNA聚合酶，TaKaRa公司；羧苄青霉素、氯霉素，生工生物工程(上海)股份有限公司；质粒大提试剂盒，生工生物工程(上海)股份有限公司；其他化学试剂均为国产分析纯。微量分光光度计，岛津公司；荧光共聚焦显微镜，奥林巴斯(中国)有限公司。

1.1.3 培养基

LB培养基参照文献[8]配制；马铃薯葡萄糖琼脂固体培养基(potato dextrose agar，PDA)参照文献[9]配制。

1.2 方法

1.2.1 镁硅酸盐纳米粘土的制备

将4.2 g MgCl₂⋅6H₂O溶于100 g乙醇中，然后向该溶液中滴入6.5 mL的3-氨丙基三乙氧基硅烷(APTES)，加入的同时不断地搅拌，5 min后溶液变成白色浆液，继续搅拌过夜，然后6 000 r/min离心10 min分离沉淀，用250 mL乙醇漂洗2次，40 ℃干燥即获得镁硅酸盐纳米粘土。称取粘土0.1 g，溶于100 g无菌超纯水中制成1 g/L悬浮液备用^[10]。

1.2.2 pCAMBIA1303-gpdA-GFP-TrpC-Hygro质粒和镁硅酸盐纳米粘土载体复合物的制备

挑取含pCAMBIA1303-gpdA-GFP-TrpC-Hygro质粒的大肠杆菌Top10单菌落于LB液体培养基(含50 μg/mL卡那霉素)中，37 ℃、200 r/min振荡培养16 h用于质粒提取。采用质粒大提试剂盒提取质粒pCAMBIA1303-gpdA-GFP-TrpC-Hygro，提取完成后采用微量分光光度计测定质粒浓度，并调整为1 μg/μL备用。将1 g/L镁硅酸盐纳米粘土悬浮液用无菌超纯水稀释成25、50、75、100、150、200、250 mg/L这7个不同的浓度，取质粒5 μL加入100 μL不同浓度镁硅酸盐纳米粘土悬浮液中，充分涡旋，室温孵育5 min，得到质粒-镁硅酸盐纳米粘土载体复合物。

1.2.3 转化用深绿木霉HB20111分生孢子悬液的制备与萌发

用5 mL灭菌蒸馏水从培养5 d的PDA平板上洗下深绿木霉HB20111菌株的分生孢子，3 000 r/min离心2 min收集，灭菌蒸馏水调整孢子浓度为1×10⁸个/mL分生孢子悬液，按10% (体积分数)接种量将悬液接种于PDB培养基中，28 ℃、120 r/min振荡培养过夜，在显微镜下观察孢子的萌发情况。

1.2.4 镁硅酸盐纳米粘土介导质粒转化

取100 μL质粒-镁硅酸盐纳米粘土载体复合物和100 μL木霉悬浮液以1:1的体积比混合，将混合液放入超声波清洗机中，在超声波输出功率为100 W/cm²、发射频率为50 kHz条件下超声30 s，涂布在含150 μg/mL潮霉素和0.1%曲酮的抗性平板上，28 ℃恒温培养箱中黑暗条件下培养5 d；以野生型深绿木霉HB20111作对照，观察野生型能否在抗性平板上生长。统计转化子，计算转化率。

1.2.5 转化体系条件优化

在转化过程中，采用单因素法考察分生孢子浓度(10⁴、10⁵、10⁶、10⁷、10⁸个/mL)、纳米粘土浓度(25、50、75、100、150、200、250 mg/L)、深绿木霉HB20111分生孢子悬液培养时间(0、4、8、12、16、20 h)和超声时间(10、20、30、60、90、120 s)对转化率的影响，每个处理4个重复，超声波输出功率、发射频率和培养温度等条件保持不变。

1.2.6 深绿木霉HB20111转化子PCR验证

将转化子转接到60 mm平板于28 ℃恒温培养1−2 d，待木霉长出新生菌丝后，采用快速制备DNA模板的方法^[11]制备菌落PCR模板，用潮霉素引物hph-F (5′-ACAGCGTCTCCGACCTGAT-3′)和hph-R (5′-3′GCTCCATACAAGCCAACCAC-3′)扩增hph基因，产物用1%琼脂糖电泳检测。

1.2.7 转化子的稳定性检测

将深绿木霉HB20111转化子在不含潮霉素的PDA固体平板上连续转接5代后，再接种至含150 μg/mL潮霉素的PDA固体平板上，以不含潮霉素的PDA固体平板为对照，观察转化子的生长情况。同时，快速制备DNA模板扩增hph基因进行PCR验证。

1.2.8 深绿木霉HB20111转化子的表达检测

将PCR验证无误的转化子于PDA固体平板培养3−4 d至产分生孢子，然后挑取少量菌丝和孢子于载玻片上，滴加无菌水，使菌丝及孢子展开，制成水压片，在荧光共聚焦显微镜激发波长为488 nm、发射波长为510 nm下观察菌丝及孢子中绿色荧光蛋白的表达。

2 结果与分析 2.1 深绿木霉孢子过夜萌发状态

深绿木霉HB20111在PDB培养基中于28 ℃、120 r/min振荡培养过夜，孢子处于萌动状态(图 1)，萌发率为45%左右。

2.2 深绿木霉HB20111的转化

质粒-镁硅酸盐纳米粘土载体复合物和木霉悬浮液经超声处理后，悬浮液平均涂布于3个含150 μg/mL潮霉素和0.1%曲酮的抗性平板，28 ℃恒温培养箱中黑暗条件下培养5 d后，能在抗性平板上正常生长的菌落初步断定为转化子，而野生型深绿木霉HB20111在抗性平板中不能生长(图 2)。

2.3 深绿木霉HB20111转化子的PCR检测

随机挑选10株深绿木霉HB20111转化子快速制备菌落PCR模板，PCR扩增潮霉素基因，以1303质粒为阳性对照、野生型深绿木霉HB20111为阴性对照，除阴性对照外其余菌株均可检测到约700 bp的条带(图 3)。说明质粒已经整合到深绿木霉HB20111基因组中。

2.4 木霉转化子遗传稳定性检测

从转化平板中随机选取10株未经过PCR验证的深绿木霉转化子在不含潮霉素的PDA平板连续转接5代，然后再转接到含潮霉素的PDA平板上，其中2株转化子不能继续在抗性平板上正常生长(图 4)。PCR检测发现这2株转化子无法扩增出潮霉素基因条带，其余8株则可以扩增出潮霉素基因条带，说明上述8株转化子潮霉素基因已整合到深绿木霉HB20111基因组中并可以稳定遗传。

2.5 转化体系条件优化

深绿木霉HB20111分生孢子浓度、纳米粘土浓度、深绿木霉HB20111分生孢子悬液培养时间^[12]和超声时间对转化效率均有明显影响(图 5)，转化效率随分生孢子浓度增加而升高，当分生孢子浓度在10⁶个/mL时转化效率最高，继续提高分生孢子浓度转化效率则会降低，同时可能导致涂布抗性平板后的转化子过多而不利于转化子的挑选；镁硅酸盐纳米粘土浓度在100 mg/L条件下转化效率较高，较低和较高的纳米粘土浓度均不利于深绿木霉的转化，如在25 mg/L和250 mg/L浓度下仅为2−3个转化子/μg-DNA，推测在较低的浓度下形成的质粒-镁硅酸盐纳米粘土载体复合物导入木霉分生孢子的量不足，所以转化子较少，而高浓度的纳米粘土则产生抑菌作用，从而不利于转化子的生长；深绿木霉HB20111分生孢子悬液在培养12−16 h时转化效率较高，培养时间低于8 h或高于20 h转化效率会显著降低；质粒-镁硅酸盐纳米粘土载体复合物与分生孢子悬液混合后超声30 s后转化效率最高，超声时间超过60 s时转化效率会快速降低，主要原因是超声时间过长对细胞产生了不可逆的损伤。

根据上述结果，确定了深绿木霉HB20111转化的最佳条件，在分生孢子浓度10⁶个/mL、纳米粘土浓度100 mg/L、深绿木霉HB20111分生孢子悬液培养12 h、超声时间30 s时转化效率最高，可达124个转化子/μg-DNA。

2.6 转化子的荧光观察

挑选经过遗传稳定性检测生长良好的转化子单孢分离后，使用荧光显微镜在488 nm蓝光激发下分别对菌丝和分生孢子进行观察，菌丝和分生孢子在激发光下均能产生强烈的绿色荧光(图 6)，表明绿色荧光蛋白可以在转化子的菌丝和分生孢子中有效表达。

3 讨论

纳米材料作为基因载体目前已经在动植物遗传转化领域得到了广泛的应用^[13-16]，纳米材料可以通过静电作用与DNA分子形成复合物，介导DNA分子传递到菌株细胞中^[17]。本文采用的纳米材料为镁硅酸盐纳米粘土，已报道其能快速吸附到细菌细胞表面，随后渗透到细胞内部成分中导致细胞膜受损，起到抗菌的作用^[18]，但如果镁硅酸盐纳米粘土的浓度保持在适当的水平，在不造成细胞严重损害的情况下则可以作为DNA分子的负载体并将其导入细胞^[10]。应用镁硅酸盐纳米粘土已经在大肠杆菌(Escherichia coli)、变形链球菌(Streptococcus mutans)、Paenibacillus riograndensis等细菌中成功进行转化，转化率为2×10⁵−6×10³个转化子/μg-质粒^[19]。除细菌外，该方法也在莱茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)转化中成功应用，克服了限制藻类细胞基因工程的转化效率瓶颈^[20]，但目前尚未发现针对丝状真菌转化的报道。

本文在参考镁硅酸盐纳米粘土介导细菌转化方法的基础上建立了针对木霉菌遗传转化的方法，本方法是对CaCl₂-PEG介导转化法、REMI、ATMT、电转化等传统丝状真菌遗传转化方法的有益补充。同时，本方法不需要制备原生质体，也不需要特殊的设备进行操作，解决了传统方法中存在的一些局限性。相较传统转化该方法具有以下优点：(1) 易于制备，适用于高通量筛选和突变子库构建；(2) 生物相容性好，是一种安全的纳米材料，生态毒性小^[21]，细胞内降解后对细胞无毒性^[22]；(3) 转化过程简单，转化效率高。实验室以传统农杆菌介导转化效率达到约20个转化子/μg-DNA，而镁硅酸盐纳米粘土介导效率是其6倍。该方法获得的转化子在多次传代的抗性平板上仍可正常生长，遗传稳定性较好。我们重点考察了镁硅酸盐纳米粘土的浓度、木霉分生孢子的浓度、分生孢子悬液培养时间和超声时间对转化效率的影响，而质粒浓度、超声波输出功率、超声波发射频率、纳米粘土的粒径分布也可能会影响转化效率。据报道，粘土的表面和体积平均直径为43.74 nm和44.93 nm，在10%、50%和99%处的累计粒径为35.86、44.31和64.60 nm^[22]。因此，转化效率还有进一步的提升空间，我们将对转化条件进行更进一步的优化和完善，以获取最佳的转化方案。此外，我们将对该方法进行拓展并建立一套丝状真菌通用的遗传转化方案。

4 结论

镁硅酸盐纳米粘土转化方案是一种简单、高效、稳定的遗传转化方法，利用它实现了对深绿木霉HB20111的高效转化，经过转化条件优化后转化效率可达124个转化子/μg-DNA，为深绿木霉HB20111突变体库的构建和进行遗传改良奠定了基础。