2022, Vol. 49扩展功能
文章信息
- 张欣宇, 董潞娜, 曹浩, 刘加鼎, 赵百锁, 王海胜
- ZHANG Xinyu, DONG Luna, CAO Hao, LIU Jiading, ZHAO Baisuo, WANG Haisheng
- 不同植物源的黄烷酮-3-羟化酶的催化特性
- Catalytic properties of flavanone-3-hydroxylase from different plants
- 微生物学通报, 2022, 49(3): 875-887
- Microbiology China, 2022, 49(3): 875-887
- DOI: 10.13344/j.microbiol.china.210533
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文章历史
- 收稿日期: 2021-06-12
- 接受日期: 2021-08-04
- 网络首发日期: 2021-10-09
2. 北京市田村路街道办事处, 北京 100043
2. Beijing Tiancun Road Sub-District Office, Beijing 100043, China
黄烷酮-3-羟化酶(flavanone-3-hydroxylase，F3H)在黄酮类化合物的生物合成途径中发挥重要作用，其主要功能包括催化柚皮素C环第3位羟基化形成二氢山奈酚(dihydrokaempferol)[1]，而后二氢山奈酚在类黄酮-3′-羟基化酶(flavonoid-3′-hydroxylase)、黄酮-3′, 5′-羟基化酶(flavonoid-3′, 5′-hydroxylase)、二氢黄酮醇还原酶(dihydroflavonol-4-reductase)、无色花青素双加氧酶(leucoanthocyanidin dioxygenase)、花青素还原酶(anthocyanidin reductase)及甲基转移酶(methyltransferase)的作用下形成槲皮素(quercetin)、山奈酚(kaempferol)、杨梅素(myricetin)、儿茶素(catechin)和异鼠李素(isorhamnetin)等一系列黄酮类化合物[2-3]。F3H是类黄酮生物合成途径中的一个重要调节点，对拟南芥突变体tt6-5的研究发现，F3H基因突变导致了突变株柚皮素含量增加和二氢山奈酚含量减少，进而造成下游一系列类黄酮含量减少，株系表现为种皮颜色、成苗颜色变浅，突变体植物对一系列非生物胁迫(氧化胁迫、盐胁迫)更加敏感[4]。因此，F3H是类黄酮代谢调节的中枢位点[5]，在植物次生代谢过程中发挥重要作用。
系统进化分析发现，黄酮类化合物合成途径中的F3H来源于共同的祖先，虽然各个物种的F3H具有明显的亲缘差异性，但它们的氨基酸序列非常保守[6]。F3H普遍含有2-酮戊二酸依赖的双加氧酶(2-oxoglutarate-dependent dioxygenase，2-ODD)超家族成员保守结构功能区域，但该区域内氨基酸的位置或种类可能存在差异。这种功能位点氨基酸的变化将直接或间接地影响酶的催化性能。茶树、金花茶、浙江红花茶的3种F3H在氨基酸序列上有9个差异位点，表现出不同的花青素合成能力[7]。
本研究对GenBank数据库进行检索，选取18种植物来源的F3H蛋白，使用MEGA-X软件采用邻接(neighbor-joining)法构建系统进化树，根据进化树的拓扑结构选取3种进化关系相对较远的F3H蛋白，即茶树CsF3H、大豆GmF3H和银杏GbF3H。本研究对以上3种F3H进行了体外酶学性质分析并进行异源表达，比较其在原核宿主和真核宿主内的催化能力，以期为研究黄酮类化合物代谢工程中F3H的选用提供参考。
1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 基因序列GenBank数据库中获得茶树(Camellia sinensis)、银杏(Ginkgo biloba)和大豆(Glycine max)的F3H基因(CsF3H的登录号为AY641730.1、GbF3H的登录号为AY742228.1、GmF3H的登录号为NM_001249868.2)由南京金斯瑞生物科技有限公司分别根据大肠杆菌(Escherichia coli)、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)的密码子偏好性进行优化合成。
1.1.2 菌株和质粒E. coli DH5α及E. coli BL21(DE3)感受态细胞购自北京博迈德生物技术有限公司，菌株S. cerevisiae WAT11由安徽农业大学王云生教授惠赠，pETM6[8]、pET-32a (TrxA-His6标签)和pESC-URA载体均由本实验室保存。
1.1.3 培养基LB培养基(g/L)：NaCl 10.0，胰蛋白胨10.0，酵母提取物5.0，如需添加氨苄青霉素(ampicillin，Amp) 100 μg/mL。酵母浸出粉胨葡萄糖(yeast extract peptone dextrose，YPD)液体培养基(g/L)：胰蛋白胨20.0，酵母提取物10.0，葡萄糖20.0。酵母缺陷型SC-URA培养基(g/L)：SC-URA Broth 8.0，半乳糖20.0，用1.0 mol/L NaOH溶液调节培养基pH至5.8，用于酿酒酵母基因工程菌的筛选及发酵培养。以上培养基均在1×105 Pa灭菌30 min。
1.1.4 主要试剂和仪器柚皮素、二氢山奈酚标准品，北京索莱宝科技有限公司；甲醇、乙酸乙酯、乙腈(色谱纯)、Taq DNA聚合酶、T4 DNA连接酶及限制性内切酶Spe I、Nde I、EcoR I，Thermo公司；高纯度质粒提取试剂盒、胶回收试剂盒，Omega公司；ClonExpress Ultra One Step Cloning Kit，南京诺唯赞生物科技有限公司；BCA蛋白浓度测定试剂盒，TaKaRa公司。引物合成和测序工作由生工生物工程(上海)股份有限公司完成。
PCR仪，Bio-Rad公司；凝胶成像分析系统，Syngene公司；液相色谱仪，Agilent公司；超声波细胞粉碎机，Branson公司；ÄKTA Avant多维蛋白纯化系统，GE公司。
1.2 方法 1.2.1 F3H系统发育分析从NCBI数据库中获得18个不同植物的F3H蛋白序列，用Clustal X[9]进行同源序列比对，然后利用MEGA-X基于Kimura双参数模型(Kimura- 2-parameter，K2P)[10]采用邻接法[11]构建系统进化树，使用1 000次重复检测的bootstrap值[12]表示树上各节点的置信度。
1.2.2 F3H氨基酸序列理化性质分析使用ExPASy ProtParam工具在线预测CsF3H、GbF3H和GmF3H的分子量、等电点、稳定系数及疏水性等基本理化性质。
1.2.3 载体的构建F3H纯化表达载体的构建：根据同源重组的引物设计原则，分别为目的片段和载体添加同源臂，设计正反向引物(表 1)。以pET-32a为模板，用F3H-F和F3H-R扩增出载体的线性化片段；以合成的pUC57-CsF3H、pUC57-GbF3H和pUC57-GmF3H为模板，用pET-32a-F和pET- 32a-R扩增出F3H线性化片段，将目的片段与载体采用试剂盒连接，产物转入E. coli DH5α感受态细胞中，均匀涂布到含有100 μg/mL Amp的LB平皿上，37 ℃培养过夜，重组阳性质粒进行测序验证。
| 引物名称 Primer name |
引物序列 Primer sequence (5ʹ→3ʹ) |
| CsF3H-F | ATCATCATCATTCTTCTGGTATGGCGCCGACCACCAC |
| CsF3H-R | GGAGCTCGAATTCGGATCCTTACGCAAAAATTTCGTCGGTGCTCT |
| GbF3H-F | CATCATCATCATTCTTCTGGTATGGCGCCGGTGCAGAG |
| GbF3H-R | CGGAGCTCGAATTCGGATCCCTATTTGCTTTCATCTTGCTGCAGCT |
| GmF3H-F | TCATCATCATTCTTCTGGTATGGCGCCGACCGCGAAGA |
| GmF3H-R | CGGAGCTCGAATTCGGATCCTTACGCCAGAATCTCTTTCAGCGGCTT |
| pET-32a-F | ACCAGAAGAATGATGATGATGATGGTGC |
| pET-32a-R | GGATCCGAATTCGAGCTCCGTC |
F3H原核及真核表达载体的构建：构建原核表达载体时，将3个F3H基因(CsF3H、GbF3H、GmF3H)与pETM6分别使用Nde I和Spe I进行双酶切；构建真核表达载体时，将F3H与载体pESC-URA分别使用EcoR I和Spe I进行双酶切；使用T4 DNA连接酶将酶切产物进行连接，连接产物转化到E. coli DH5α中，挑取单克隆进行菌落PCR鉴定，并测序验证。
1.2.4 F3H的诱导表达与纯化将活化的种子液按1%接种量转接到100 mL含有Amp的LB液体培养基中，37 ℃、180 r/min培养至OD600处于0.6−0.8之间，加入异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(isopropyl-beta- D-thiogalactopyranoside，IPTG)至终浓度为0.5 mmol/L进行诱导表达，16 ℃、220 r/min培养16−18 h。随后培养物在4 ℃、5 000 r/min离心10 min收集菌体，再将细胞重悬于裂解缓冲液(5 mmol/L Na2HPO4·12H2O、10 mmol/L NaH2PO4·2H2O、500 mmol/L NaCl、30 mmol/L咪唑)中，用超声波细胞破碎仪(超声功率为40 W，工作3 s，间歇5 s，共破碎30 min)破碎细胞，随后4 ℃、13 000 r/min离心45 min收集破碎上清液作为粗酶液。使用HisTrapTM HP纯化柱对粗酶液进行纯化。预先用5倍柱体积的裂解缓冲液平衡纯化柱，上样完成之后用5倍体积的裂解缓冲液洗去杂蛋白，再用10倍体积的洗脱缓冲液(5 mmol/L Na2HPO4·12H2O、10 mmol/L NaH2PO4·2H2O、500 mmol/L NaCl、500 mmol/L咪唑)洗脱目的蛋白，根据峰值收集纯酶。使用BCA蛋白浓度测定试剂盒测定纯酶浓度，SDS-PAGE电泳分析酶纯化后的分子量和纯化程度。
1.2.5 F3H的酶学性质研究F3H酶活测定按照Owens等[13]的方法进行，酶反应体系(500 µL)：50 mmol/L (pH 7.5) Tris-HCl，纯酶10 µg，0.5 mmol/L柚皮素，50 µmol/L FeSO4，10 mmol/L抗坏血酸，10 mmol/L 2-酮戊二酸，于35 ℃恒温孵育10 min后，加入1 mL乙酸乙酯终止反应，吸出上层的乙酸乙酯，用N2吹干，再用1 mL甲醇重新溶解样品，用HPLC检测反应产物。试验重复3次，以不加酶的反应体系为对照组。F3H的酶活定义为：在最适反应条件下，蛋白每分钟催化生成1 µmol二氢山奈酚所消耗的酶量为一个酶活力单位U。
pH对F3H酶活性的影响：在35 ℃反应条件下，在不同pH的Na2HPO4-CA (pH 4.0−6.5)，50 mmol/L Tris-HCl (pH 7.8−8.5)，50 mmol/L Gly-NaOH (pH 9.0−10.5)缓冲液中，每0.5为一个间隔，用上述方法测定F3H的酶活力，最高酶活力记为100%，分别计算各pH下的相对酶活力。其中，不加酶的体系作为对照组，所有组均设置3个重复。
温度对F3H酶活性的影响：在最适pH条件下，在不同温度(5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60 ℃)下用上述反应体系和方法测定不同F3H的活性，最高酶活力记为100%，分别计算各温度下的相对酶活力。其中，不加酶的体系作为对照组，所有组均设置3个重复。
F3H的催化及动力学特性分析：以不同浓度(2、5、10、20、50、100、200、500 μmol/L)的柚皮素为底物，依次在最适温度和最适pH条件下反应10 min，通过Lineweaver-Burk双倒数法计算Km、kcat和kcat/Km。
1.2.6 F3H在不同宿主内的催化能力比较F3H在原核宿主中的表达：将表达载体pETM6-CsF3H、pETM6-GbF3H、pETM6-GmF3H转化至E. coli BL21(DE3)中，于37 ℃培养过夜。将阳性重组子活化后按1:100的比例接种至100 mL含有Amp的LB液体培养基中，培养至菌液OD600处于0.6−0.8之间时加入IPTG至终浓度为500 μmol/L进行诱导表达，30 ℃、180 r/min诱导5 h，向菌液中加入底物柚皮素(底物用二甲基亚砜溶解)至终浓度为500 μmol/L，继续培养24 h。取1 mL发酵菌液，加入等体积甲醇，涡旋振荡提取5 min，12 000 r/min离心10 min，通过HPLC检测上清中二氢山奈酚的产生量。
F3H在真核宿主中的表达：将表达载体pESC-URA-CsF3H、pESC-URA-GbF3H、pESC- URA-GmF3H电击转化至S. cerevisiae WAT11中，均匀涂布在SC-URA固体培养基上，于30 ℃下培养48 h。出现约1 mm的单菌落后，挑选阳性单克隆菌落接种至20 mL含有半乳糖的SC-URA液体培养基中，30 ℃、180 r/min培养24 h作为种子液。将种子液按5:100的比例再次接种于上述培养基中，培养至OD600处于0.6−0.8之间，加入柚皮素至终浓度为500 μmol/L，30 ℃、220 r/min发酵培养48 h。取1 mL菌液，用上述方法萃取处理样品。
1.2.7 二氢山奈酚的检测液相色谱条件：色谱柱为Eclipse XDB C18 (4.6 mm×150 mm，5 μm)，进样量为5 μL，流动相为乙腈和超纯水，梯度洗脱。洗脱程序参照周天山等[14]的方法，分离洗脱17 min，柱温为25 ℃，检测波长为280 nm。
2 结果与分析 2.1 F3H系统进化分析对18个不同来源的F3H进行系统进化分析(图 1)，银杏F3H (Ginkgo biloba Q5XPX2)与辐射松F3H (Pinus radiata A0A088BGJ0)属于裸子植物，分支最早。大豆F3H (Glycine max Q53B69)与拟南芥F3H (Arabidopsis thaliana Q9S818)归于同一个进化支，亲缘关系最近。茶树F3H (Camellia sinensis Q6DV45)与樱桃F3H (Prunus avium F2VR47)、樱桃李F3H (Prunus cerasifera A0A0K1TPE7)处于同一分支，具有较近的亲缘关系。从进化树上看，CsF3H、GbF3H、GmF3H的遗传距离相对较远，截至目前，关于CsF3H[15]、GbF3H[16]和GmF3H[17]的研究主要集中在基因的克隆、组织特异性表达等方面，系统地比较CsF3H、GbF3H和GmF3H酶学性质以及在不同底盘细胞内的催化能力差异的研究还未有报道。因此，本研究选取CsF3H、GbF3H、GmF3H为目标蛋白进行下一步研究。
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| 图 1 基于氨基酸序列的黄烷酮-3-羟化酶系统进化树分析 Figure 1 Phylogenetic analysis of flavanone-3-hydroxylase based on amino acid sequences. 括号内为相应蛋白序列在UniProt中的登录号；分支上的数值为自举值大于50%的结果；线段0.05代表进化距离单位 The numbers in parentheses represent the accession numbers in the UniProt for the corresponding protein sequences; Bootstrap values more than 50% are shown at branching points; Bar, 5 amino acid substitution per 100 amino acids of protein sequence. |
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CsF3H、GbF3H和GmF3H的分子量分别为41.46、40.41和42.67 kDa (表 2)，理论等电点分别为5.61、5.57和5.55。3种蛋白的总平均亲水性小于0，不稳定系数均大于40，属于亲水性不稳定蛋白，其中，GbF3H的不稳定系数远高于CsF3H和GmF3H，在体外环境下更不稳定。预测显示，CsF3H的总平均亲水性较低、脂溶性系数较高、不稳定系数适中，相比于GbF3H和GmF3H更有机会折叠成较稳定的高级结构，行使生物催化功能[18]。
| Physical and chemical properties | CsF3H | GbF3H | GmF3H |
| 分子量 Molecular weight (kDa) |
41.46 | 40.41 | 42.67 |
| 等电点 Isoelectric point |
5.61 | 5.57 | 5.55 |
| 蛋白质不稳定系数 Instability index |
47.72 | 56.88 | 45.45 |
| 脂溶性系数 Aliphatic index |
85.87 | 82.44 | 80.08 |
| 总平均亲水性 Grand average of hydropathy |
−0.40 | −0.41 | −0.55 |
为了增加F3H的稳定性，将F3H的N-端与TrxA标签融合后在E. coli BL21(DE3)中表达。有关F3H的报道显示，去除TrxA标签的过程会造成F3H蛋白水解，对酶活性的影响较大[19-20]。因此，本研究关于F3H酶活性的分析都是在TrxA-F3H融合蛋白的状态下进行的。SDS-PAGE电泳结果显示，在相对分子质量约55 kDa处有目标蛋白条带(图 2)，与生物信息学预测的蛋白大小一致(融合标签的分子量约为14 kDa)。
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| 图 2 F3H蛋白的SDS-PAGE分析 Figure 2 SDS-PAGE analysis of F3H protein. M：蛋白质分子量标准；A：CsF3H；B：GbF3H；C：GmF3H M: Protein molecular weight standard; A: CsF3H; B: GbF3H; C: GmF3H. |
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3种F3H能够发挥酶活性的pH范围相似(图 3)。GbF3H的最适反应pH值为7.0，而CsF3H和GmF3H的最适反应pH值为7.5。随着pH值的升高，酶活力呈先升高后下降的趋势。在pH 6.0−8.0范围内，3种F3H都表现出80%的酶活力，pH 5.0−8.0内，仍有50%以上的酶活力。对于GbF3H和GmF3H，在pH＞8.0时酶活力大幅度降低，而此时CsF3H的酶活力仍能维持相对较高的水平，在pH 9.0时仍表现出60.9%的酶活力，表明其耐碱性更高，发挥酶活力的pH范围更为广泛。
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| 图 3 pH对F3H催化能力的影响 Figure 3 Effects of pH on the catalytic efficiency of F3H. The results present the mean±SD of three replicates. |
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3种F3H所能耐受的温度范围大致相似(图 4)。CsF3H和GbF3H的最适反应温度为40 ℃，而GmF3H的最适反应温度为35 ℃。三者在15−60 ℃范围内均有活性，在25−45 ℃之间保留60%以上酶活力。当温度由40 ℃上升到50 ℃时，CsF3H和GmF3H的酶活力几乎呈直线式降至35%以下，在50 ℃时GmF3H仅有15.1%的酶活力。相比之下，GbF3H对这一阶段的温度变化不敏感，在50 ℃时仍有72.1%的酶活力，而当温度继续升高至55 ℃时，GbF3H的酶活力骤降至20.1%。相较于CsF3H和GmF3H，GbF3H发挥酶活力的温度范围更为广泛。
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| 图 4 温度对F3H催化能力的影响 Figure 4 Effects of temperature on the catalytic efficiency of F3H. 结果为3次重复的平均值±标准差 The results present the mean±SD of three replicates. |
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如表 3所示，CsF3H、GbF3H和GmF3H米氏常数Km值分别为52.75、28.61、63.68 μmol/L，即3个酶中GbF3H对底物柚皮素的亲和力最大。kcat/Km值依次为CsF3H＞GmF3H＞GbF3H，表明CsF3H酶对柚皮素的转化效率更高，催化能力最强。
| Recombinant F3H | Km (μmol/L) | kcat (s−1) | kcat/Km (L/(mmol·s)) |
| CsF3H | 52.75 | 0.019 0 | 0.360 |
| GbF3H | 28.61 | 0.002 5 | 0.087 |
| GmF3H | 63.68 | 0.017 0 | 0.270 |
将含有pETM6-CsF3H、pETM6-GbF3H和pETM6-GmF3H的E. coli BL21(DE3)发酵24 h后，通过HPLC检测发酵液中二氢山奈酚的产生量，结果发现3种F3H均表现出酶活性。其中，CsF3H能将500 µmol/L柚皮素转化为428.6 µmol/L二氢山奈酚，转化率高达85.7%；GmF3H次之，对柚皮素的转化率为82.5%，但GbF3H仅能催化产生119.2 µmol/L二氢山奈酚，转化率为23.8%，远远低于前2种F3H的催化活性(图 5)。因此，当以E. coli为底盘细胞构建基因工程菌时，来自被子双子叶植物的CsF3H和GmF3H更适用于二氢山奈酚的发酵生产。
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| 图 5 不同F3H在Escherichia coli BL21(DE3)中催化能力分析 Figure 5 Catalytic capacities of different F3H in Escherichia coli BL21(DE3). 数据采用one-way ANOVA方差分析(LSD法)，数据柱形标注不同小写字母表示差异显著(P＜0.05) The data was analyzed using one-way ANOVA and LSD test, value columns with different lowercase letters mean significant difference (P < 0.05), the same below. |
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将含有pESC-URA-CsF3H、pESC-URA-GbF3H和pESC-URA-GmF3H的S. cerevisiae WAT11喂饲底物柚皮素，培养48 h后通过HPLC检测F3H对柚皮素的转化情况。3种F3H均能将柚皮素转化为二氢山奈酚(图 6)。CsF3H的催化能力最高，能催化生成222.1 µmol/L二氢山奈酚，GbF3H的催化能力稍低于CsF3H，GmF3H的催化能力相对最弱。CsF3H、GbF3H和GmF3H对柚皮素的转化率分别为44.4%、43.2%和41.4%，三者的差异不明显。
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| 图 6 不同F3H在Saccharomyces cerevisiae WAT11中催化能力分析 Figure 6 Catalytic capacities of different F3H in Saccharomyces cerevisiae WAT11. |
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通过代谢工程提高代谢产物产量首先需要构建最优的生物合成途径，基因来源、酶表达水平、酶活性和特殊酶性质都会影响代谢通量和产量[21-22]。目前，多种植物源F3H的酶活性已经得到表征，但活性普遍较低。因此，利用微生物宿主异源合成二氢山奈酚等羟基化黄酮的产量也受到限制[23]。二氢山奈酚的低积累量也严重限制了其下游化合物的高效积累。因此，选用高活性的、与宿主适配性好的F3H是利用代谢工程手段高效生产二氢山奈酚等3位羟基化黄酮的关键手段之一[24]。
研究表明，在氨基酸水平上，不同植物源的F3H相似性很高，其中，铁离子结合位点(HxDxnH)和2-酮戊二酸结合位点(RxS)的氨基酸种类相同，仅仅在位置上有所变动[25-26]。CsF3H蛋白序列中5个保守功能氨基酸(H218、D220、H276、D286、S288)与GmF3H中同功能氨基酸(H219、D221、H277、D287、S289)在序列上的相对位置保持一致[27-28]，而GbF3H功能活性位点(H225、D227、H282、D292、S294)中H282的相对位置与CsF3H、GmF3H序列上同功能氨基酸的相对位置不一致[16]。这可能使GbF3H蛋白的结构和酶活性与CsF3H、GmF3H产生较大差异。本研究中生物信息学分析显示，3种F3H都属于亲水性蛋白，CsF3H、GbF3H和GmF3H在等电点上没有明显差别，经SDS-PAGE检测，3种F3H的分子量与其同源蛋白的分子量大小相符[29-30]。同源建模与晶体学研究显示，无论F3H的氨基酸序列差异如何，这些酶采用了非常相似的空间构型，即活性位点包藏在β-片层形成的拓扑结构中，多肽的C-末端形成覆盖活性位点腔的盖子，以尽可能降低蛋白氧化水解损伤、去折叠的几率，稳定酶的活性中心[31-32]。蛋白稳定性的强弱会对蛋白的功能产生一定的影响[18]。在过量表达外源基因进行花色遗传育种时，结构稳定性更高的浙江红花茶CcF3H被认为是合成花青素的优选酶[7]。本研究中，理化性质预测的结果显示CsF3H的稳定性最好，GbF3H的稳定性较差。因此，CsF3H被认为具有更强的催化能力。
对酶学性质分析发现，CsF3H和GmF3H的最适pH为7.5，GbF3H的最适pH为7.0，比兰花(Ascocenda orchid)[33] (pH 8.0)和黄花蒿(Artemisia annua)[34] (pH 8.5)的最适pH低，但CsF3H的最适pH与已报道的茶树(Camellia sinensis) [35] F3H的最适pH相一致。3种F3H均在中性条件下酶活力较高，在强酸和强碱条件下几乎无催化活性。F3H蛋白发挥作用的温度条件较为温和，研究发现矮牵牛PhF3H在温度为37 ℃时酶活力最佳[36]；拟南芥AtF3H的最适反应温度为40 ℃[13]。本研究中的3种F3H在35−40 ℃范围内能发挥最大活性。酶的催化动力学显示，GbF3H蛋白对柚皮素的亲和力最强，但CsF3H对柚皮素的转化率更快，催化效率也更高，具有更好的开发利用潜能，这与理化性质预测结果一致。
在微生物代谢工程中，E. coli是理想的宿主，也是黄酮发酵生产研究中最常用的原核宿主之一。目前已经在E. coli中成功构建了如漆黄素、甲基香橙素等多种高价值黄酮的异源合成途径[37-38]。本研究中3种植物来源的F3H成功在E. coli表达。含有CsF3H和GmF3H的菌株二氢山奈酚的产生量高出GbF3H转化菌株4倍左右，即GbF3H对底物柚皮素的催化能力远低于CsF3H和GmF3H，这可能与酶自身的不稳定性以及与宿主的适配性有关[39]。相较于原核细胞，S. cerevisiae拥有更为成熟的细胞膜系统且遗传背景清楚。现有研究认为，S. cerevisiae在表达类黄酮等相关真核基因元件上占有一定优势[40-42]。本研究对含F3H的单基因酵母工程菌株进行底物发酵，发现3种F3H在底物柚皮素利用上无明显差异，GbF3H的催化能力也与CsF3H和GmF3H相当，可能是GbF3H自身的特性使其更适应于真核细胞的环境[16]。对于同一种F3H，其在原核和真核细胞内的催化能力还存在明显不同。在原核细胞内，酶对柚皮素的转化能力明显高于真核细胞(GbF3H除外)，并且在原核细胞中，酶所展现出的催化特性与体外酶学特性及理化性质分析的结果更吻合，这可能与酶对底物的作用能力不同及酶对细胞微环境的适应能力差异有关[43-44]。因此，对于同一种F3H，其在不同底盘生物中的催化能力也存在差异。
在类黄酮代谢途径研究中，关键酶的分析是解析类黄酮生物合成调控机制的重要途径，本研究在分子水平上为研究黄酮类化合物的生物合成提供了思路与理论依据，具有很大的应用前景。同时我们的结果也印证了在利用代谢工程生产目的产物时，选择合适的宿主也是至关重要的。
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