2022, Vol. 49
表1(Table 1)
荧光假单胞菌CLW17菌株pqqE和GDH基因的功能
扩展功能
文章信息
- 刘艳, 曹永清, 孟静, 晋婷婷, 任嘉红
- LIU Yan, CAO Yongqing, MENG Jing, JIN Tingting, REN Jiahong
- 荧光假单胞菌CLW17菌株pqqE和GDH基因的功能
- Functional analysis of pqqE and GDH genes in Pseudomonas fluorescens CLW17 strain
- 微生物学通报, 2022, 49(2): 529-544
- Microbiology China, 2022, 49(2): 529-544
- DOI: 10.13344/j.microbiol.china.210709
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文章历史
- 收稿日期: 2021-08-05
- 接受日期: 2021-09-13
- 网络首发日期: 2021-10-28
刘艳, 曹永清, 孟静, 晋婷婷, 任嘉红. 荧光假单胞菌CLW17菌株pqqE和GDH基因的功能[J]. 微生物学通报, 2022, 49(2): 529-544.
LIU Yan, CAO Yongqing, MENG Jing, JIN Tingting, REN Jiahong. Functional analysis of pqqE and GDH genes in Pseudomonas fluorescens CLW17 strain[J]. Microbiology China, 2022, 49(2): 529-544.
荧光假单胞菌CLW17菌株pqqE和GDH基因的功能
1. 山西师范大学生命科学学院, 山西 临汾 041000;
2. 长治学院生命科学系, 山西 长治 046011
2. 长治学院生命科学系, 山西 长治 046011
摘要: 【背景】 磷是植物生长所必需的大量元素，但绝大多数不能被植物吸收利用。然而溶磷微生物能够分泌有机酸来溶解土壤中难溶性磷，提高土壤中磷的利用率，促进植物生长，提高作物的产量和品质。【目的】 探究高效解磷荧光假单胞菌CLW17菌株的pqqE和GDH基因的生理学功能。【方法】 利用生物在线软件对2个基因编码蛋白进行生物信息学分析。利用同源重组技术分别获得pqqE和GDH基因缺失突变株(CLW17ΔpqqE，CLW17ΔGDH)，并使用接合转移的方式获得回补菌株(ΔpqqE/pqqE，ΔGDH/GDH)。分别采用NBRIP培养基、钼锑抗比色法及高压液相色谱法(HPLC)对野生型、突变株及互补株的溶磷及产有机酸能力进行检测。【结果】 pqqE和GDH基因编码氨基酸数目分别为390和803，均无信号肽。pqqE无跨膜结构域，而GDH预测有5个跨膜结构域。pqqE和GDH基因是CLW17菌株的溶磷相关基因，2个基因的缺失均使该菌株的溶磷能力显著下降，而回补株可以恢复溶磷能力。CLW17野生株能分泌多种有机酸，其中葡萄糖酸(gluconic acid，GA)含量最多，其次是乙酸；但敲除株产有机酸的能力明显降低，尤其是产GA能力与空白培养基对照相差甚微，而且无乙酸产生。【结论】 pqqE和GDH基因是CLW17溶磷能力发挥的关键基因，该菌株溶磷能力与产有机酸尤其是产GA和乙酸密切相关。本研究为进一步研究该菌株与南方红豆杉的互作和溶磷机制奠定了基础。
关键词:
荧光假单胞菌 溶磷基因 基因敲除 同源重组 南方红豆杉
Functional analysis of pqqE and GDH genes in Pseudomonas fluorescens CLW17 strain
1. School of Life Science, Shanxi Normal University, Linfen 041000, Shanxi, China;
2. Department of Life Science, Changzhi College, Changzhi 046011, Shanxi, China
2. Department of Life Science, Changzhi College, Changzhi 046011, Shanxi, China
Abstract: [Background] Phosphorus is a macronutrient for plant growth, but most of it cannot be absorbed by plants. Phosphate-solubilizing microorganism (PSM) can secrete organic acids to dissolve the insoluble soil phosphates, improve plant growth, crop yield and quality by increasing phosphorus utilization. [Objective] The research aims to study the physiological functions of pqqE and GDH genes in the Pseudomonas fluorescens CLW17 strain. [Methods] Bioinformatics analyses have been done for two gene encoding proteins using bioinformatics software. We obtain two deletion mutant strains (CLW17ΔpqqE and CLW17ΔGDH) of pqqE and GDH gene by homologous recombination technology, and the corresponding supplementary strains (ΔpqqE/pqqE and ΔGDH/GDH) were obtained using the combined transfer method. The phosphate solubilizing abilities and organic acid production abilities of wild-type, mutant strains, and complementary strains were detected by NBRIP medium, molybdenum anti colorimetry method, and high-pressure liquid chromatography (HPLC) method, respectively. [Results] The numbers of amino acids encoded by pqqE and GDH genes were 390 and 803, respectively. There is no signal peptide for both genes. pqqE had no transmembrane domain, while GDH predicted five transmembrane domains. The pqqE and GDH genes are the phosphate-solubilizing genes of the CLW17 strain, and the deletion of the two genes greatly reduces the phosphate-solubilizing ability of this strain, moreover, the complementary strains of these two genes can restore the phosphate-solubilizing ability. Wild strain CLW17 can secrete a variety of organic acids, among which gluconic acid content is the highest, followed by acetic acid. The ability to produce organic acids in the knocked-out strain was greatly reduced, especially the ability to produce gluconic acid and acetic acid. [Conclusion] The pqqE and GDH genes are the key genes for the phosphate solubilization of the CLW17 strain, the phosphate solubilization ability of the strain is closely related to the production of organic acids, especially gluconic acid and acetic acid. This study laid the foundation for further study on the interaction and phosphorus solubilization mechanism between the strain and Taxus chinensis var. mairei.
Keywords:
Pseudomonas fluorescens phosphate-solubilizing gene gene knockout homologous recombination Taxus chinensis var. mairei
磷(phosphorus)是植物生长所必需的营养元素之一，在植物生长发育的各个方面都起着至关重要的作用[1]。在土壤中，磷以有机化合物和无机化合物的形式存在，其中大多数都不能被植物利用，导致植物因缺磷而阻碍生长发育。在土壤中分布有大量具有很强溶磷能力的微生物，能够将植物难以吸收的磷转化为可利用的形态，人们把具有这种能力的微生物称为溶磷微生物(phosphate-solubilizing microorganism，PSM)[2]。PSM的种类繁多，不同微生物的溶磷方式不一样。目前已报道的不少溶磷细菌菌株的溶磷机制被认为主要是葡萄糖酸(gluconic acid，GA)的分泌[3]。其中，溶磷细菌分泌的主要GA来自细菌葡萄糖氧化作用的第一步，需要葡萄糖脱氢酶(glucose dehydrogenase，GDH)催化，而GDH通常需要辅助因子才能催化GA的生成，目前在多个属细菌中发现吡咯喹啉醌(pyrroloquinoline quinone，PQQ)作为GDH的氧化辅助因子[4]。截至目前所报道的产GDH细菌菌株的pqq突变体往往丧失分泌GA的能力[5]。以PQQ为辅酶的醌蛋白葡萄糖脱氢酶与PQQ结合成具有活性的全酶后便能催化葡萄糖生成GA。微生物的PQQ合成相关基因往往以基因簇的形式存在，不同来源的pqq基因数目不同[6]。目前报道的产PQQ细菌均具有pqqA、pqqB、pqqC、pqqD、pqqE和pqqF这6个基因簇[7-8]，在一些细菌如荧光假单胞菌B16中还有pqqG、pqqH、pqqI、pqqJ、pqqK和pqqM基因[9]。其中，pqqE对PQQ的生物合成至关重要[10]。
荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens) CLW17是分离自南方红豆杉根际的一株高效溶磷细菌，该菌株具有产生长素、嗜铁素及固氮、解钾、溶解无机磷等促生长特性，对南方红豆杉有明显的促生长作用[11]。前期实验结果表明，CLW17菌株有较强的溶无机磷能力，但其溶磷机制尚未见报道。目前该菌株已完成全基因组测序和注释，通过基因组注释分析，CLW17菌株中具有GDH和pqqE基因。鉴于此，本研究对CLW17菌株GDH和pqqE基因的功能进行研究，以期为揭示CLW17菌株的溶磷促生机制奠定基础，并为构建更有效的植物根际促生菌(plant growth promoting rhizobacteria，PGPR)提供理论基础。
1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 供试菌株和质粒本实验所采用的菌株及质粒如表 1所示。
表 1 本实验中使用的菌株和质粒
Table 1 Strains and plasmids used in this experiment
| Strains or plasmids | Description | Reference or source |
| Strains | ||
| Pseudomonas fluorescens CLW17 | Wild-type isolated from rhizosphere of Taxus chinensis var. mairei | Lab collection |
| CLW17ΔpqqE | pqqE in-frame deletion in CLW17 | This study |
| CLW17ΔGDH | GDH in-frame deletion in CLW17 | This study |
| ΔpqqE/pqqE | CLW17ΔpqqE complementation | This study |
| ΔGDH/GDH | CLW17ΔGDH complementation | This study |
| Escherichia coli S17-1 | recA, thi, pro, RP4-2-Tc: : Mu-Km: : Tn7 | Lab collection |
| Plasmids | ||
| pEX18Gm | Suicide vector, sacB, GmR | Lab collection |
| pJN105 | Replenishment vector, GmR | Gift from University of Washington |
| S17-1/pEx18Gm-pqqE | pEx18Gm containing pqqE upstream and downstream, GmR | This study |
| S17-1/pEx18Gm-GDH | pEx18Gm containing GDH upstream and downstream, GmR | This study |
| S17-1/pJN105-pqqE | pJN105 containing pqqE, GmR | This study |
| S17-1/pJN105-GDH | pJN105 containing GDH, GmR | This study |
感受态制备试剂盒，宝生物工程(大连)有限公司；质粒提取试剂盒、酶切产物纯化试剂盒以及胶回收试剂盒，天根生化科技(北京)有限公司；限制性内切酶BamH I-HF，EcoR I-HF，Hind III-HF，Nhe I-HF和Spe I-HF，北京NEB公司；庆大霉素、氨苄青霉素，上海Sigma公司。
高效液相色谱仪，安捷伦科技有限公司；PCR仪，Eppendorf公司；凝胶成像仪，Bio-Rad公司；恒温培养箱，上海一恒科学有限公司；紫外/可见分光光度计，上海美谱达仪器有限公司。
1.1.3 培养基LB：胰蛋白胨10 g，酵母提取物5 g，NaCl 10 g，蒸馏水1 000 mL，pH 7.0–7.5。
NA：牛肉膏3 g，蛋白胨10 g，NaCl 5 g，蒸馏水1 000 mL，pH 7.0–7.2，琼脂18–20 g。
NB：无琼脂的NA。
LAS：胰蛋白胨10 g，酵母提取物5 g，15%蔗糖，蒸馏水1 000 mL，pH 7.0–7.5。
NBRIP：葡萄糖10 g，磷酸三钙5 g，MgCl2 5 g，KCl 0.2 g，七水硫酸镁0.25 g，蒸馏水1 000 mL，pH 7.0。
1.2 方法 1.2.1 生物信息学分析利用ProtParam、SignalP 5.0、TMHMM、SOPMA、Motif Scan和Conserved Domains等在线分析软件，分析荧光假单胞菌CLW17菌株中pqqE和GDH基因编码蛋白的性质，同时使用MEGA 7.0对其编码蛋白进行系统发育树的构建。
1.2.2 菌株抗生素敏感性测试取荧光假单胞菌CLW17野生菌株菌悬液(108 CFU/mL)各100 μL，分别涂布于含常用抗生素的LB固体培养基上，并倒置于30 ℃恒温培养箱24-36 h后，观察其生长状况，以确定该菌株对不同抗生素的敏感性。
1.2.3 敲除载体的构建以CLW17菌株的基因组DNA为模板，采用表 2中的CLW17_DpqqE_FW/CLW17_DelpqqE_ FW、CLW17_DpqqE_RV/CLW17_DelpqqE_RV、CLW17_DGDH_FW/CLW17_DelGDH_FW、CLW17_DGDH_RV/CLW17_DelGDH_RV引物对，运用表 3的PCR反应体系，通过PCR反应条件(94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 50 s，30个循环；72 ℃ 5 min)扩增pqqE和GDH基因上、下游同源臂片段；采用表 2的CLW17_ DpqqE_FW/CLW17_DpqqE_RV、CLW17_DGDH_ FW/CLW17_DGDH_RV引物对，利用Overlap PCR技术将上、下游片段连接在一起，用Hind III-HF和BamH I-HF对pqqE基因重叠片段和质粒pEX18Gm进行双酶切，用Hind III-HF和EcoR I-HF对GDH基因重叠片段和质粒pEX18Gm进行双酶切，将片段和载体连接转化进大肠杆菌感受态中，通过筛选得到敲除载体。将该载体命名为S17-1/pEX18Gm-pqqE和S17-1/pEX18Gm-GDH。
表 2 研究中使用的引物
Table 2 Primers used in this study
| Primer name | Sequence (5′→3′) |
| CLW17_DpqqE_FW | GGCAAGCTTAGGCTACGAATATTTCCGCA |
| CLW17_DelpqqE_FW | AAAGGCTCAGCCTTTGGCGATCGATGACTCAGGCAAGTTCGA |
| CLW17_DpqqE_RV | CGCGGATCCCGGAAAATCCTTTCTCGGAG |
| CLW17_DelpqqE_RV | TCGAACTTGCCTGAGTCATCGATCGCCAAAGGCTGAGCCTTT |
| CLW17_DpqqE_SQFW | GATCCGGATCAATTGCGTTCCCAAGAACTG |
| CLW17_DpqqE_SQRV | CTAGCTAACGGTTGCAAACCATTTGCCGAC |
| CLW17_CompDpqqE_FW | CCGGAATTCTCATGGAGGTTGCCCATGC |
| CLW17_CompDpqqE_RV | CGGACTAGTTCAGCCTTTGGCGATGAGGC |
| CLW17_DGDH_FW | CCCAAGCTTGAACTCTATTACGGCGTGCACG |
| CLW17_DelGDH_FW | GCCGCCGGCGGTGACGATCGAGGCGTACAGGCCCAATGCCGC |
| CLW17_DGDH_RV | CCGGAATTCTGGTCGACCAGGGAATGGATAC |
| CLW17_DelGDH_RV | GCGGCATTGGGCCTGTACGCCTCGATCGTCACCGCCGGCGGC |
| CLW17_DGDH_SQFW | ATCGACAACTACGTCCAGGCCAGTCTGGT |
| CLW17_DGDH_SQRV | TCTTTGAATCGGCGGATTCGTAGGGTGAG |
| CLW17_CompDGDH_FW | CTAGCTAGCACGGAGAACCACACTATGAG |
| CLW17_CompDGDH_RV | CGGACTAGTTTATTCCGGCAGTTTGTACG |
| M13_FW | TGTAAAACGACGGCCAGT |
| M13_RV | CAGGAAACAGCTATGACC |
表 3 Q5 polymerase PCR反应体系
Table 3 Q5 polymerase PCR reaction system
| Component | Volume (μL) |
| 5×Q5 Reaction Buffer | 10.0 μL |
| 10 μmol/L dNTP Mix | 1.0 μL |
| 10 μmol/L primer FW | 2.5 μL |
| 10 μmol/L primer RV | 2.5 μL |
| Template DNA | Variable |
| Q5 Polymerase (2 U/μL) | 0.5 μL |
| H2O | To 50.0 μL |
将敲除载体S17-1/pEX18Gm-pqqE和S17-1/pEX18Gm-GDH分别与CLW17野生型菌株进行接合转移：取0.5 mL供体菌，9 000 r/min离心3 min收集菌体，用LB重悬2次，收集菌体。取0.5 mL受体菌株，9 000 r/min离心3 min，弃上清，用50 μL LB重悬。将受体菌与供体菌混合并全部转移至不含抗生素的LB平板中，30 ℃培养过夜。通过菌落PCR验证筛选单交换阳性克隆株，将验证正确的单交换阳性克隆划线在LAS平板中发生同源重组，利用15%蔗糖平板筛选出不含sacB基因的重组子，分别使用CLW17_DpqqE_FW/CLW17_DpqqE_RV和CLW17_ DGDH_FW/CLW17_DGDH_RV引物对进行PCR验证，将验证正确的单菌落使用CLW17_ DpqqE_SQFW/CLW17_DpqqE_SQRV和CLW17_ DGDH_SQFW/CLW17_DGDH_SQRV引物对进行PCR验证，将验证正确的单菌落送去测序，测序正确的突变体命名为ΔpqqE和ΔGDH。
1.2.5 回补株的构建以CLW17为模板，分别采用CLW17_Comp DpqqE_FW/CLW17_CompDpqqE_RV和CLW17_ CompDGDH_FW/CLW17_CompDGDH_RV引物对扩增pqqE和GDH基因。使用EcoR I-HF/Spe I-HF和Nhe I-HF/Spe I-HF对胶回收后的产物和载体pJN105分别进行双酶切，并使用T4 DNA ligase进行连接。将连接产物通过热转法转入到大肠杆菌S17-1感受态细胞中，37 ℃培养过夜。挑选单克隆进行菌落PCR验证，将验证正确的单克隆送去测序。将测序正确的回补载体命名为S17-1/pJN105-pqqE和S17-1/pJN105-GDH。
将回补载体S17-1/pJN105-pqqE和S17-1/pJN105-GDH通过接合转移的方法分别转入ΔpqqE和ΔGDH菌株中，即可得到回补株ΔpqqE/pqqE和ΔGDH/GDH，采用引物M13-FW和M13-RV对回补株进行PCR电泳检测。
1.2.6 溶磷能力的检测(1) 溶磷圈的检测：用接种针将CLW17的野生菌株、ΔpqqE、ΔGDH、ΔpqqE/pqqE和ΔGDH/GDH菌株点接于NBRIP固体培养基平板[12]上，30 ℃恒温培养箱中培养7 d后，观察菌落周围是否产生透明圈。
(2) 可溶性磷含量的测定：将野生菌株CLW17、ΔpqqE、ΔGDH、ΔpqqE/pqqE和ΔGDH/GDH菌株在NA培养基中活化，30 ℃、180 r/min培养过夜，后分别接种于NB培养基，30 ℃、180 r/min振荡培养18-24 h制成种子液，取0.5 mL种子液接种于含50 mL NBRIP培养液的100 mL三角瓶中，以接0.5 mL空白种子液的NBRIP培养基为对照，每个处理3个重复。30 ℃、180 r/min振荡培养4 d后，收集发酵液于4 ℃、12 857×g离心10 min，取上清液，采用钼锑抗比色法测定上清液的有效磷含量。
1.2.7 产有机酸测定将荧光假单胞菌CLW17的野生株、GDH及pqqE基因敲除株分别接种于牛肉膏蛋白胨培养基，28 ℃、180 r/min培养18-24 h制成种子液，按1%接种量接入NBRIP培养基中，以不接菌的培养基为对照，30 ℃、180 r/min振荡培养72 h后，6 000 r/min离心30 min收集发酵液，取5 mL发酵液上清液用0.22 μm孔径滤膜过滤，采用高效液相色谱仪测定有机酸的种类和含量。色谱条件为：色谱柱为菲罗门C18柱，缓冲液为0.05 mol/L磷酸二氢钾(pH 2.0-3.0)，柱温为30 ℃，流速为1.0 mL/min，检测波长为214 nm。
2 结果与分析 2.1 pqqE和GDH基因及其编码蛋白的生物信息学分析 2.1.1 理化性质分析使用ProtParam在线软件对pqqE和GDH基因进行在线分析，结果如表 4所示，pqqE基因的开放阅读框为1 188 bp，编码的蛋白理论分子质量为44.03 kDa，pI为6.04，平均亲水指数为-0.391，脂溶指数是78.10，分子式为C1949H3035N549O575S21，不稳定指数(PI)为36.59，为稳定蛋白；GDH基因的开放阅读框为2 427 bp，编码的蛋白理论分子质量为86.35 kDa，pI为6.13，平均亲水指数为-0.079，脂溶指数是85.54，分子式C3879H6046N1034O1137S31，不稳定指数(PI)为35.14，为稳定蛋白。
表 4 CLW17菌株溶磷基因的基本理化性质分析
Table 4 Basic physicochemical properties of CLW17 phosphate-solubilizing gene
| Gene name | Gene length (bp) | Theoretical relative molecular mass (kDa) | Theoretical isoelectric point (pI) | Instability index (PI) | Average hydrophilic index | Lipolysis index | Molecular formula |
| pqqE | 1 188 | 44.03 | 6.04 | 36.59 | -0.391 | 78.10 | C1949H3035N549O575S21 |
| GDH | 2 427 | 86.35 | 6.13 | 35.14 | -0.079 | 85.54 | C3879H6046N1034O1137S31 |
使用SignalP 5.0在线软件对pqqE和GDH编码蛋白进行信号肽的预测，结果如图 1、图 2所示，2个基因的编码蛋白pqqE和GDH均无信号肽。
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| 图 1 pqqE蛋白信号肽预测 Figure 1 Signal peptide prediction of pqqE protein. |
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| 图 2 GDH蛋白信号肽预测 Figure 2 Signal peptide prediction of GDH protein. |
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使用TMHMM在线软件对pqqE和GDH蛋白进行分析，结果如图 3、图 4所示，pqqE蛋白无跨膜结构域，是一种外膜蛋白；GDH蛋白预测拥有5个跨膜结构域，为跨膜蛋白。
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| 图 3 pqqE蛋白跨膜结构预测 Figure 3 Prediction across membrane region of pqqE protein. |
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| 图 4 GDH蛋白跨膜结构预测 Figure 4 Prediction across membrane region of GDH protein. |
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使用SOPMA在线软件对pqqE和GDH蛋白进行分析与预测，结果如图 5、图 6所示，pqqE和GDH蛋白均含有α-螺旋、β-链、β-折叠和无规则卷曲，在pqqE蛋白中分别占40.0%、39.0%、3.9%和46.1%；在GDH蛋白中分别占18.6%、22.2%、8.1%和51.2%。
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| 图 5 pqqE蛋白二级结构分析 Figure 5 Secondary structure analysis of pqqE protein. h：α-螺旋；e：β-链；t：β-折叠；c：无规则卷曲 h: α-helix; e: β-chain; t: β-fold; c: Random coil. |
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| 图 6 GDH蛋白二级结构分析 Figure 6 Secondary structure analysis of GDH protein. h：α-螺旋；e：β-链；t：β-折叠；c：无规则卷曲 h: α-helix; e: β-chain; t: β-fold; c: Random coil. |
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运用Motif Scan在线软件对pqqE和GDH蛋白进行分析，结果表明：pqqE蛋白中酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位点为78-81、321-324、344-347、351-354，N-肉豆蔻酰化位点为108-113、144-149、212-217、330-335，蛋白酶K磷酸化位点为32-34、145-147、172-174；GDH蛋白中，N-糖基化位点为374-377、701-704，蛋白激酶磷酸化位点为646-649，酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位点为149-152、211-214、247-250、276-279、372-375、376-379、427-430、479-482、493-496、570-573、645-648、703-706、749-752、770-773，N-肉豆蔻酰化位点为32-37、48-53、126-131、229-234、350-355、368-373、382-387、412-417、489-494、502-507、538-543、653-658、659-664、687-692、723-728、783-788、789-794，蛋白酶磷酸化位点为7-9、247-249、271-273、325-327、469-471、562-564、645-647、692-694、703-705、749-751、770-772。
2.1.6 蛋白保守结构域分析运用Conserved Domains在线软件对pqqE和GDH蛋白进行分析，结果表明：pqqE蛋白含有1个PQQ-syn-pqqE功能域，是一种典型的肽环化自由基SAM酶，其将Try连接到Glu中，作为前体肽pqqA合成辅酶PQQ的第一步。该蛋白含有radocal SAM superfamily，该家族的酶通过4Fe-4S簇与S-腺苷甲硫氨酸(S-adenosyl methionine，SAM)近距离结合产生自由基。它们的特征是一个保守的CxxxCxC基序，该基序协调了保守的铁硫团簇。从机理上讲，它们共同将单个电子从铁硫簇转移到SAM上，导致其还原裂解为甲硫氨酸和5′-脱氧腺苷酸自由基，进而从适当位置的碳原子处抽出氢气。根据酶的不同，SAM在此过程中被消耗或被恢复和重复使用。自由基SAM酶具有催化代谢、DNA修复、维生素和辅酶的生物合成以及多种抗生素的生物合成的作用(图 7)。
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| 图 7 pqqE保守结构域分析 Figure 7 Conserved domains of pqqE. |
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GDH蛋白含有4个功能域，分别为PQQ- membr-DH、PQQ-mGDH、Gcd和PQQ；有2个超家族蛋白结构，最主要的是PQQ-DH-like superfamily。PQQ-membr-DH功能域具有与辅酶PQQ生物合成酶非常相似的系统发育分布，如部分系统发育分析所示，该家族成员在N端区域有多个预测的跨膜螺旋，包括大肠杆菌的喹蛋白葡萄糖脱氢酶和不动杆菌属的酸/莽草酸脱氢酶ADP1；PQQ-mGDH功能域的细菌亚家族的酶属于以PQQ为辅因子的脱氢酶家族，是唯一与膜结合的亚家族。葡萄糖脱氢酶将D-葡萄糖转化为D-葡萄糖-1, 5-内酯，在革兰氏阴性菌糖和醇的周质氧化过程中与呼吸链偶联。PQQ_DH_like超家族蛋白家族是由PQQ作为辅因子的脱氢酶组成，如乙醇、甲醇和膜结合葡萄糖脱氢酶(图 8)。
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| 图 8 GDH保守结构域分析 Figure 8 Conserved domains of GDH. |
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使用MEGA 7.0软件构建进化树，结果如图 9、图 10所示，菌株CLW17的pqqE和GDH蛋白与假单胞菌属的亲缘关系最近。
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| 图 9 荧光假单胞菌CLW17菌株pqqE蛋白与其他不同菌株pqqE蛋白的进化关系 Figure 9 The evolutionary relationship between pqqE protein of Pseudomonas fluorescens CLW17 and pqqE protein of other strains. 邻接法构建系统发育树；节点上数字表示interior-branch值；括号内表示菌株GenBank号；箭头所指为本项目的CLW17菌株；比例尺表示核苷酸替换率 The phylogenetic tree was constructed by neighbor-joining model; The number on the node indicating the interior-branch value; The GenBank accession number of each strain was indicated in brackets; The CLW17 strain used in this study was indicated as black arrow; Scale bar indicates nucleotide substitution rate. |
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| 图 10 荧光假单胞菌CLW17菌株GDH蛋白与其他不同菌株GDH蛋白的进化关系 Figure 10 The evolutionary relationship between GDH protein of Pseudomonas fluorescens CLW17 and GDH protein of other strains. 邻接法构建系统发育树；节点上数字表示interior-branch值；括号内表示菌株GenBank号；箭头所指为本项目的CLW17菌株；比例尺表示核苷酸替换率 The phylogenetic tree was constructed by neighbor-joining model; The number on the node indicating the interior-branch value; The GenBank accession number of each strain was indicated in brackets; The CLW17 strain used in this study was indicated as black arrow; Scale bar indicates nucleotide substitution rate. |
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对CLW17菌株进行氨苄青霉素、庆大霉素这2种抗生素的敏感性检测，实验结果表明，将荧光假单胞菌CLW17原始菌株涂布于分别含有氨苄青霉素、庆大霉素的LB固体培养基上，CLW17原始菌株均无生长迹象，说明该菌株对2种抗生素均敏感。这表明后续可以采用携带庆大霉素筛选标记的pEX18Gm和pJN105载体进行CLW17菌株的基因敲除和回补。
2.3 敲除株的筛选通过同源重组技术分别获得ΔpqqE和ΔGDH的缺失突变株，结果如图 11所示，1-4泳道扩增出的条带大小约为1 300 bp，明显小于阳性对照野生株的大小，说明pqqE基因缺失突变体构建成功；泳道5-10扩增出的条带大小约为1 500 bp，明显小于阳性对照野生株的大小，通过测序进一步表明GDH基因缺失突变体构建成功。
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| 图 11 ΔpqqE和ΔGDH PCR验证结果电泳图 Figure 11 PCR validation of ΔpqqE and ΔGDH. M1、M3：DL2000 DNA Marker；M2：DL5000 DNA Marker；1-4：以不同的ΔpqqE单菌落为模板的PCR结果电泳图；5-10：以不同的ΔGDH单菌落为模板的PCR结果电泳图；CK+：以野生型菌株为模板的PCR扩增；CK-：无模板的PCR扩增 M1, M3: DL2000 DNA Marker; M2: DL5000 DNA Marker; 1-4: Using different ΔpqqE single colonies as templates of PCR; 5-10: Using different ΔGDH single colonies as templates of PCR; CK+: Use wild type strain as template of PCR; CK-: Without template of PCR. |
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由图 12可知，与阳性对照(CK+)相比，泳道1-6扩增出大小相等的条带，说明回补质粒已成功导入ΔpqqE内，回补菌株ΔpqqE/pqqE构建成功；泳道12-17扩增出与阳性对照大小相等的条带，说明回补质粒已成功导入进ΔGDH内，回补菌株ΔGDH/GDH构建成功。
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| 图 12 ΔpqqE/pqqE和ΔGDH/GDH PCR验证结果电泳图 Figure 12 PCR validation of ΔpqqE/pqqE and ΔGDH/GDH. M1-M4：DL5000 DNA Marker；1-6：以不同的ΔpqqE/pqqE单菌落为模板的PCR结果电泳图；12-17：以不同的ΔGDH/GDH单菌落为模板的PCR结果电泳图；CK+：以回补载体为模板的PCR扩增；CK-：无模板的PCR扩增 M1-M4: DL5000 DNA Marker; 1-6: Using different ΔpqqE/pqqE single colonies as templates of PCR; 12-17: Using different ΔGDH/GDH single colonies as templates of PCR; CK+: Using complementation vector as template of PCR; CK-: Without template of PCR. |
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分别将CLW17的野生菌株、ΔpqqE、ΔGDH、ΔpqqE/pqqE和ΔGDH/GDH菌株点种于NBRIP培养基平板上，30 ℃恒温培养箱中培养7 d后，如图 13所示，敲除株ΔpqqE和ΔGDH在NBRIP培养基上生长较弱，菌落周围无溶磷圈出现，而野生型CLW17、回补株ΔpqqE/pqqE和ΔGDH/GDH有明显的溶磷圈出现，其中ΔpqqE/pqqE和ΔGDH/GDH产生的溶磷圈比野生型CLW17略大一些，周围未降解完全。这说明pqqE和GDH基因的敲除使CLW17菌株几乎丧失了溶磷能力，同时也暗示2个基因的功能与溶磷相关。
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| 图 13 NBRIP板上溶磷圈的大小 Figure 13 Solution circle of inorganic phosphate on NBRIP. |
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分别采用钼锑抗比色法测定不同菌株发酵4 d的NBRIP上清液中可溶性磷的含量，结果如表 5所示。CLW17野生株、敲除株ΔpqqE、敲除株ΔGDH、回补株ΔpqqE/pqqE和回补株ΔGDH/GDH可溶磷的含量分别是289.074、146.860、144.983、398.198和409.462 mg/L。与野生株相比，敲除株ΔpqqE和ΔGDH发酵液的可溶性磷含量明显下降，而回补株ΔpqqE/pqqE和ΔGDH/GDH的可溶性磷含量恢复并有明显的提升。以上结果也说明了pqqE基因和GDH基因在该菌株的溶磷过程中应该是起着关键性作用。
表 5 CLW17野生菌株、ΔpqqE、ΔGDH、ΔpqqE/pqqE和ΔGDH/GDH菌株的溶磷能力
Table 5 The ability of soluble phosphorus of original bacteria strain, ΔpqqE, ΔGDH mutants, ΔpqqE/pqqE and ΔGDH/GDH complements
| Manage | Phosphate-solubilizing quantity (mg/L) |
| CLW17 | 289.074±0.007c |
| CLW17ΔpqqE | 146.860±0.003d |
| CLW17ΔGDH | 144.983±0.010d |
| ΔpqqE/pqqE | 398.198±0.029b |
| ΔGDH/GDH | 409.462±0.033ab |
| CK | 6.993±0.001e |
| 注：不同小写字母表示差异显著(P < 0.05)
Note: Different lowercase letters represented significant difference (P < 0.05). | |
采用HPLC对CLW17野生株、敲除株ΔpqqE、ΔGDH的NBRIP培养基发酵4 d的上清液产有机酸情况进行检测。由表 6可以看出，CLW17野生株在其溶磷过程中分泌了有机酸，并且有机酸分泌总量为5 534.77 μg/mL，显著高于培养基空白对照(716.66 μg/mL)，增加了672.30%，说明该菌株分泌的有机酸在溶磷过程中起着很重要的作用。CLW17野生株分泌的有机酸有4种，分别为草酸、GA、乙酸和苹果酸，相较于对照，GA和乙酸的含量增加。草酸、苹果酸与空白对照相比相差甚微，而GA为4 429.33 μg/mL，相比其他酸的产量显著提升，同时产乙酸量高达1 079.63 μg/mL，而在对照中未检测到乙酸。敲除株ΔpqqE、ΔGDH产有机酸检测结果进一步验证了这2种有机酸的作用。2株敲除株除了新出现的乳酸(87.80 μg/mL，44.39 μg/mL)，产有机酸的种类和量与空白对照相似，产GA的量分别为516.95 μg/mL和560.25 μg/mL，与对照(679.42 μg/mL)差别较小，都明显低于野生株(4 429.33 μg/mL)，另外敲除株的发酵液中未检测到乙酸。进一步说明GA和乙酸可能在CLW17菌株的溶磷过程中起着重要作用。
表 6 荧光假单胞CLW17野生株、敲除株ΔpqqE和ΔGDH分泌的有机酸种类和浓度
Table 6 The kinds and concentrations of organic acids excreted by wild strain and knocked out strains ΔpqqE and ΔGDH of Pseudomonas fluorescent CLW17
| Organic acid | Content (μg/mL) | |||
| CK | CLW17 (Wild type) | ΔpqqE | ΔGDH | |
| 草酸Oxalic acid | 29.42 | 22.35 | 27.10 | 24.91 |
| 葡萄糖酸 Gluconic acid |
679.42 | 4 429.23 | 516.95 | 560.25 |
| 酒石酸 Tartaric acid |
3.99 | - | 3.33 | 4.87 |
| 乙酸Acetic acid | - | 1 079.63 | - | - |
| 乳酸Lactic acid | - | - | 87.80 | 44.39 |
| 苹果酸Malic acid | 3.82 | 3.56 | 4.69 | 2.75 |
| 甲酸Formic acid | - | - | - | - |
| Total acid | 716.66 | 5 534.77 | 639.86 | 637.17 |
| Note: -: Not detected. | ||||
在土壤中接种PSM是将不溶性磷转化为植物有效磷的有效途径，可促进植物生长，提高作物产量和品质。可以说，PSM是无机磷肥的辅助性促生剂，有助于满足植物对磷的需求，促进可持续农业的发展。据报道，接种假单胞菌MS16溶磷细菌制备成的菌剂接种小麦后，小麦的籽粒产量和植株磷含量均显著高于对照[13]。Zhao等的研究发现，接种溶磷菌株Burkholderia cepacia SCAUK0330的玉米生物量显著高于对照，并且能够耐受5%的NaCl，在较宽的温度(10-40 ℃)和pH值(4.0-10.0)范围内生长，说明其在广泛的环境条件下可以被用作植物生长促进剂和生物防治剂[14]。
微生物的溶磷机制存有多种观点，一般认为是微生物向周围分泌质子、有机酸等物质。有机酸产生的种类和产量已成为筛选和评估PSM效率高低的标准[15]。已经报道的PSM分泌的有机酸主要有GA、酒石酸、丙烯酸、乳酸、柠檬酸、甲酸、丙酮酸、戊二酸、苹果酸和草酸等，这些有机酸通过与Fe3+、Al3+、Ca2+、Mg2+发生螯合作用结合，从而将难溶性的磷酸盐溶解[16]，其中GA和2-酮基-葡萄糖是最常见的有机酸。不同的溶磷菌株产生的有机酸种类也有所不同。一些Burkholderia sp.菌株通过产生GA、乙酸、柠檬酸、丁酸、乳酸、琥珀酸、苹果酸、乙醇酸、富马酸、丙酸、甲酸等多种有机酸，从而使该类菌株在溶解不溶性磷酸盐方面具有很高的效率[17-18]。例如，Zeng等在解磷细菌伯克霍尔德氏菌WS-FJ9的磷酸盐增溶过程中检测到GA和丙酮酸[19]。目前已报道的假单胞菌属的溶磷菌株中，GA是其发挥溶磷作用时产生的主要有机酸。例如，Chen等筛选到一株假单胞菌PSB12，研究发现PSB12菌株产生的有机酸组成取决于磷的形式，当初始可溶性磷不足时GA是主要有机酸；当仅提供可溶性磷时，甲酸、丁酸和丙二酸是其产生的主要有机酸[20]。我们通过HPLC发现荧光假单胞菌CLW17分泌的有机酸主要是GA和乙酸，这暗示该菌株的溶磷能力可能与产GA和乙酸有关。
目前已克隆的溶磷细菌促进无机磷溶解的基因主要是与产有机酸有直接关系或起调节作用的基因。不少溶磷细菌菌株在葡萄糖脱氢酶GDH和辅助因子吡咯喹啉醌PQQ的共同作用下，将葡萄糖氧化为GA，降低pH值，从而使难溶性无机磷转化为可溶性磷[21]。Bharwad等的研究结果表明，琥珀酸对Acinetobacter sp. SK2的抑制机制是通过抑制mGDH和sGDH的活性来抑制磷的溶解[22]。PQQ作为氧化还原酶的一种辅酶，合成途径一般均具有pqqA、pqqB、pqqC、pqqD、pqqE和pqqF这6个基因。其代谢合成的详细机制截至目前尚未解析清楚。Goldstein等最早从草生欧文氏菌中分离得到pqqE溶磷基因，该基因能促进细菌对无机磷的吸收，证明了该基因具有溶磷功能[23]。Tripura等从肠杆菌科中成功克隆了GDH基因，缺失GDH基因的敲除株便丧失GDH的活性，致使该菌不能溶解土壤中的难溶性磷酸盐[24]。本文通过同源重组和接合转移的方法成功构建了荧光假单胞菌CLW17菌株pqqE和GDH基因敲除株及回补株。通过CLW17菌株野生株和突变株溶磷能力的定性、定量结果发现，2个基因的敲除虽然显著降低了该菌株的溶磷能力，但并没有使其溶磷能力完全消失，同时回补株使其溶磷能力得到恢复并有所提高。这些结果表明pqqE和GDH基因在CLW17菌株的溶磷过程中应该起着关键性作用，但可能还存在其他的溶磷途径。本研究通过HPLC对荧光假单胞菌CLW17野生株及敲除株发酵液中有机酸的检测发现，CLW17野生株在溶磷的过程中分泌了4种有机酸，分别为草酸、GA、乙酸和苹果酸。其中，草酸和苹果酸水平与空白对照持平，而敲除株中分泌GA的含量明显下降，与空白对照持平，同时在发酵液中未检测到乙酸，但新出现了乳酸。本研究结果表明GA和乙酸是荧光假单胞菌CLW17主要分泌的有机酸，在该菌株的溶磷过程中可能发挥着重要作用。
为了在分子水平真正揭示荧光假单胞菌CLW17菌株的溶磷机制，在后续研究中，我们仍需要继续开展CLW17菌株其他基因的功能研究，探索这些基因对其溶磷能力的影响，寻找出其他可能的溶磷途径。此外，通过对荧光假单胞菌CLW17基因组中基因的分析，我们认为有机酸的产生、植物激素的产生、固氮和产生嗜铁素是促进南方红豆杉生长的主要机制，而且前期实验也证明了该菌株具有以上功能。同时，盆栽实验也表明该菌株对南方红豆杉具有显著促生长作用[25]。因此，CLW17菌株可作为南方红豆杉人工栽林土壤微生物磷肥使用的菌株资源之一，这一方法对减轻化学磷肥的有害影响非常重要。
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