羊肚菌(Morchella spp.)隶属于子囊菌门(Ascomycota)盘菌纲(Pezizomycetes)盘菌目(Pezizales)羊肚菌科(Moechellaceae)羊肚菌属(Morchella)^[1-2]。羊肚菌肉质脆嫩、味道鲜美，富含蛋白质、大量人体必需氨基酸、多种维生素及高含量的铁和锌等多种矿质元素^[3-5]，营养和药用价值极高，位居世界四大野生名菌之首。在羊肚菌属已知的61个物种中，东亚或中国分布有30种，是该属的现代物种多样性中心^[6]。羊肚菌具有生态多样性，在该属中既有腐生菌物种，也有共生菌物种，甚至还有腐生-共生兼性的物种。2012年之前，羊肚菌主要靠野外采集，2012年后随着外援营养袋的使用及易出菇菌株的获得，我国羊肚菌大田种植技术在全国范围内得到推广。然而，出菇不稳定、不出菇、产量不高等问题普遍存在，究其原因是对羊肚菌出菇原理的研究不够。

羊肚菌是一种土生菌，不覆土羊肚菌无法出菇，可见土壤中含有特定刺激其结实的有益因子^[7]。土壤中除了营养物质，丰富的土壤微生物对其生长也有一定的影响。沈洪等^[8]采用PCR-DGGE技术对云南羊肚菌内生细菌多样性的研究表明，内生细菌中主要有拟杆菌门、变形菌门和厚壁菌门，这些细菌可能与羊肚菌的生长关系密切。熊川等^[9]对采集的8个野生羊肚菌发生地的菌塘土样和2个非菌塘土样进行分析，结果表明羊肚菌菌塘土壤细菌多样性指数和丰度比非菌塘土壤高。张相锋等^[10]采用Biolog-EC法，分析不同深度羊肚菌根际土壤微生物多样性，结果表明羊肚菌根际土壤微生物多样性随土层加深而减小，上层具有较高的多样性。杨晓绒等^[11]采用高通量测序技术测定了昭苏县野生羊肚菌不同土层深度的细菌类群，结果显示10-20 cm土层微生物多样性较高，含有丰富的固氮菌。

关于羊肚菌根际土壤理化性质方面的研究报道很少，主要集中于羊肚菌野生生境的调查，重点关注适合羊肚菌菌丝生长的土壤理化性质^[12-15]。土壤酶主要来源于土壤微生物，但又影响土壤微生物的数量及群落结构，是土壤物质运动和能量交换中最活跃的因素，也是衡量土壤肥力、土壤养分吸收及转化的重要指标之一^[16-17]。赵苗等^[18]测定了羊肚菌生长过程中的土壤酶活变化规律，结果表明羊肚菌大田播种以后，蔗糖酶与纤维素酶活性均呈先升高后降低的变化趋势，淀粉酶活性则呈先降低再升高后降低的变化趋势，过氧化氢酶的变化趋势却与淀粉酶相反。羊肚菌根际土壤细菌群落与土壤理化性质及酶活性之间相互关系的研究相对匮乏，该方面的研究亟需加强。

甘肃省是横跨南北最长的省份，具有独特的地理位置，研究显示甘肃省的野生羊肚菌资源物种丰富^[19-22]，为本研究的开展提供了理想的地理条件。本文采用高通量测序技术，对甘肃省不同地区羊肚菌根际土壤细菌群落组成、多样性等结构特征进行系统研究，并结合土壤理化性质和酶活性，分析羊肚菌根际微生态各要素之间的相互关系，以期揭示根际微生态系统对羊肚菌生态适应的内在机制，并为羊肚菌的人工种植及生态功能研究提供理论依据。

1 材料与方法 1.1 样品信息

根据羊肚菌在甘肃省不同区域的分布情况设置9个采样地点，具体信息见表 1。每个样点内设置3个10 m×10 m样方作为平行重复，每个样方内选取长势良好的羊肚菌，用干净的铁铲采集子实体及其周围半径5 cm、深度0-5 cm的土壤，从距离羊肚菌根际最近的位置用无菌毛刷收集土壤，混合土样，低温带回实验室，放入-80 ℃冷冻备用。

紫外分光光度计，北京普析通用仪器有限责任公司；高频红外碳硫测定仪，德阳市科瑞仪器设备厂；自动定氮仪，上海晟声自动化分析仪器有限公司；电感耦合等离子体直读光谱仪、原子荧光光谱仪，赛默飞世尔科技有限公司；离子色谱仪、火焰原子吸收仪，日立公司。

1.2 土壤理化性质及酶活性测定

土壤pH值采用酸度计测定，以去除CO₂的纯水为浸提剂，水: 土的体积质量比为2.5:1；土壤全氮采用自动定氮仪法测定；全碳使用元素分析仪测定；有机质采用重铬酸钾容量法测定；铵态氮采用自动定氮仪测定；硝态氮采用离子色谱仪测定；有效磷采用紫外-可见分光光度计测定；速效钾采用火焰原子吸收仪测定；土壤微量元素(Fe、Ca、Mg)含量采用电感耦合等离子体直读光谱仪测定；Se测定采用原子荧光仪测定。土壤含水率的测定：用0.1 g精度的天平称取土样的重量，记作土样的湿重M，在105 ℃的烘箱内将土样烘6-8 h至恒重，然后测定烘干土样，记作土样的干重Ms。土壤含水量=(烘干前铝盒及土样质量-烘干后铝盒及土样质量)/(烘干后铝盒及土样质量-烘干空铝盒质量)×100%。

土壤多酚氧化酶活性采用没食子素比色法测定；土壤过氧化物酶活性采用邻苯三酚比色法测定；土壤脲酶活性采用靛酚蓝比色法测定；脱氢酶活性采用三苯基四氮唑氯化物(triphenyltetrazolium chloride，TTC)比色法测定；土壤碱性磷酸酶活性采用磷酸苯二钠比色法测定；芳基硫酸酯酶活性、β-葡萄糖苷酶活性采用对硝基苯酚比色法测定；谷氨酰胺酶活性采用氨比色法测定。

1.3 土壤样品总DNA提取与MiSeq测序

对采集的羊肚菌根际土壤样品，利用Omega公司的土壤DNA提取试剂盒E.Z.N.A^TM Mag-Bind Soil DNA Kit对土壤总基因组DNA进行提取，采用琼脂糖凝胶电泳检测DNA的纯度和浓度。PCR引物采用细菌16S rRNA基因的V3–V4可变区通用引物341F (5′-CCTACGGGN GGCWGCAG-3′)和805R (5′-GACTACTACHVG GGTATCTAATCCG-3′)^[23]。第一轮PCR反应体系：2×Taq Master Mix 15 μL，Bar-PCR primer F (10 μmol/L) 1 μL，primer R (10 μmol/L) 1 μL，Genomic DNA 10-20 ng，加ddH₂O补足至30 μL。PCR反应条件：94 ℃ 3 min；94 ℃ 30 s，45 ℃ 20 s，65 ℃ 30 s，5个循环；94 ℃ 20 s，55 ℃ 20 s，72 ℃ 30 s，20个循环；72 ℃ 5 min。第二轮扩增引入Illumina桥式PCR兼容引物。PCR反应体系：2×Taq Master Mix 15 μL，Bar-PCR primer F (10 μmol/L) 1 μL，primer R (10 μmol/L) 1 μL，上一轮PCR产物20 ng，加ddH₂O补足至30 μL。PCR反应条件：95 ℃ 3 min；94 ℃ 20 s，55 ℃ 20 s，72 ℃ 30 s，5个循环；72 ℃ 5 min。PCR扩增产物经琼脂糖凝胶电泳检测后回收纯化，应用Illumina MiSeq 2×300 bp平台进行宏基因组测序。测序服务和生物信息分析工作由生工生物工程(上海)股份有限公司完成。

1.4 生物信息学分析

Illumina MiSeq^TM得到的原始图像数据文件经CASAVA碱基识别(base calling)分析转化为原始测序序列(sequenced read)，称为raw data或raw read。测序序列中含有barcode序列和测序时加入的引物和接头序列，首先需去除引物和接头序列，再根据PE read之间的overlap关系，将成对的read拼接成一条序列，然后按照barcode标签序列识别并区分样品得到各样本数据，最后对各样本数据的质量进行质控过滤，得到各样本有效数据(clean read)。用USEARCH 5.2.236软件对所有样品的全部clean read序列进行OTU聚类(97%的一致性)^[24]。用QIIME中的BLAST方法与RDP数据库进行物种注释分析，OTU的丰度初步表明样品的物种丰富度^[25]。获得的数据提交GenBank，获得登录号为：DS (SRR11887800、SRR11887811、SRR11887812)，DC (SRR11887790、SRR11887791、SRR11887792)，TB (SRR11887787、SRR11887788、SRR11887789)，LC (SRR11887786、SRR11887810、SRR11887809)，LK (SRR11887806、SRR11887807、SRR11887808)，ZQ (SRR11887803、SRR11887804、SRR11887805)，DB (SRR11887799、SRR11887801、SRR11887802)，LQ (SRR11887796、SRR11887797、SRR11887798)，LX (SRR11887793、SRR11887794、SRR11887795)。

1.5 数据分析

采用QIIME计算的指数，利用软件R进行稀释度曲线绘制；利用Mothur软件进行单个样品的α多样性分析，基于OTU的结果，计算Shannon指数、Chao1指数进行生物多样性分析。用RDP Classifier分析方法，基于Bergey’s taxonomy，采用Naïve Bayesian assignment算法对每条序列在不同层级水平上计算其分配到此rank中的概率值。用QIIME中的BLAST方法与Unite数据库进行物种注释分析，各组样品在不同水平上的分类比较柱形图、单个样品的群落分布柱形图使用R软件获得。为了分析土壤环境因子对羊肚菌根际土壤细菌多样性的影响，以细菌群落在门水平(取前10个门)的相对丰度数据作为物种数据，土壤的理化性质及酶活性作为土壤的环境变量，通过软件Canoco 4.5进行冗余分析(redundancy analysis，RDA)，对各样品土壤细菌类群与土壤环境因子的相关关系进行分析。用SigmaPlot 12.5软件中的one-way analysis of variance (ANOVA)分析不同采样点细菌群落在属水平的显著性差异，当P < 0.05时，认为具有显著性差异。

2 结果与分析 2.1 羊肚菌根际土壤理化性质及酶活性

由表 1可知，ZQ、DB、LQ、LX采样点羊肚菌根际土壤呈酸性，DS、DC、TB、LC、LK采样点羊肚菌根际土壤呈碱性，采样点的pH值为6.46-8.19。大量元素随海拔升高呈逐渐增加的趋势，DB采样点的大量元素含量最高，DC采样点的大量元素含量最低，各采样点微量元素的变化各异。9个采样点中，土壤多酚氧化酶(polyphenol oxidase，PPO)、过氧化物酶(peroxidase，POD)、脲酶(urease，UE)、芳基硫酸酯酶(arylsulfatase，ASF)随海拔升高呈现降低的趋势；而β-葡萄糖苷酶(β-glucosidase，β-GC)、脱氢酶(dehydrogenase，DHA)、碱性磷酸酶(alkaline phosphatase，AKP)随着海拔升高呈升高趋势；β-葡萄糖苷酶(β-glucosidase，β-GC)的活性在DB采样点显著高于其他采样点；谷氨酰胺酶(glutaminase，GLS)在各采样点变化不大。

2.2 羊肚菌根际土壤细菌群落丰度

羊肚菌根际土壤的9个样品，以大于97%相似性聚类得到43 262个细菌OTU，统计结果见表 2。各样品测序覆盖度在93%以上，样品稀释曲线(图 1)显示，随着测序样品数目的增加，9个样品的OTU稀释曲线趋于平缓，表明本实验测序的数据量渐进合理，能较全面地反映测序样品的细菌群落组成，数据量的增多对发现新的OTU数目的贡献变小。

2.3 羊肚菌根际土壤细菌组成、多样性分析

不同地区羊肚菌根际土壤在门水平上的物种组成结果显示，9个样点中共检测到27个门的细菌(图 2A)，在DS、DC、TB、LK、DB、LQ、LX采样点的优势细菌类群为变形菌门(Proteobacteria)、放线菌门(Actinobacteria)和酸杆菌门(Acidobacteria)，分别占细菌总序列数的41.59%、22.51%和12.56%，占总丰度的76.66%。在LC、ZQ采样点优势菌门为变形菌门(Proteobacteria)、放线菌门(Actinobacteria)和厚壁菌门(Firmicutes)。

在科水平上，9个根际土壤样品共注释到了202个细菌类群(图 2B)，鞘藻科(Sphingomonadaceae) (19.35%)、酸性细菌_Gp6_未分类(Acidobacteria_Gp6_unclassified) (6.85%)、扁平菌科(Planctomycetaceae) (4.99%)、杆菌科1 (Bacillaceae 1) (14.12%)为优势菌科，占总序列数目的35.31%。DS、LK样点，鞘藻科(Sphingomonadaceae)、酸性细菌_Gp6_未分类(Acidobacteria_Gp6_unclassified)和杆菌科(Bacillaceae) 1是优势菌科；DC采样点，鞘藻科(Sphingomonadaceae)、扁平菌科(Planctomycetaceae)和杆菌科(Bacillaceae) 1是优势菌科；TB、LC采样点，鞘藻科(Sphingomonadaceae)、Acidobacteria_Gp6_unclassified和Acidobacteria_ Gp16_unclassified为优势菌科；ZQ、DB、LQ、LX采样点，鞘藻科(Sphingomonadaceae)、Acidobacteria_Gp16_unclassified、扁平菌科(Planctomycetaceae)为主要优势菌科。

9个样点羊肚菌根际土壤细菌α分析结果见表 2，Shannon指数分析结果表明：LX > LQ > DS > DC > LK > LC > DB > TB > ZQ；Chao1指数分析结果为LK > LC > LX > TB > DB > LQ > DS > DC > ZQ；采样点ZQ的羊肚菌根际土壤的细菌多样性和丰富度在9个样点中最低；采样点LX、LQ的根际土壤细菌多样性最丰富，Shannon指数分别为7.18和7.13，样品LK、LC、LX根际土壤细菌丰富度最高，Chao1指数分别为8 034.40、7 938.61和7 937.96。

2.4 羊肚菌根际土壤群落结构聚类分析

根据9个样地样品在属水平上的物种注释及相对丰度数据，通过最大值排序方法，选择相对丰度排名前50的细菌属，绘制羊肚菌根际土壤细菌聚类分析热图(图 3)。9个样地中，鞘氨醇单胞菌属(Sphingomonas)、GP6、GP16、Gaiella相对丰度均较高，在TB、ZQ采样点中嗜热芽孢杆菌属(Anoxybacillus)相对丰度较其他7个采样点高，在DS、TB、DC、DB采样点中单核杆菌属(Solirubrobacter)相对丰度较其他5个采样点高，发光杆菌属(Ilumatobacter)在LC采样点的丰度较其他8个采样点低；芽孢杆菌属(Bacillus)在LC、TB采样点相对丰度较高，在LQ、DB采样点丰度很低；Gemmatimonas在LC、DS、DC、DB相对丰度较其他5个采样点高；诺卡氏菌属(Nocardioides)在DS、TB、DC和DB采样点的相对丰度较其他5个采样点高；窄食单胞菌属(Stenotrophomonas)在TB采样点明显高于其他采样点；新鞘脂菌属(Novosphingobium)在LK采样点的物种丰度最高。

2.5 羊肚菌土壤细菌群落结构与土壤环境因子相互关系

对9个采样点野生羊肚菌根际土壤细菌群落进行主成分分析，结果见图 4，细菌群落受主坐标成分PCA1与PCA2的影响分别达到95%与2%。DB、DC采样地细菌群落与PCA1轴相距较近，与PCA2轴相距较远，因此该地细菌菌群受主成分PCA1的影响较大；DS、LC、LK、LQ、LX采样点均表现为受主成分PCA1、PCA2的相互影响，并且上述7个样地在图中相聚较近，表明7个样地细菌群落结构相似；TB和ZQ采样点与其他7个采样点相距较远，而且彼此相距也较远，说明这两地的细菌群落结构与上述7个采样点差异较大，而ZQ样地的细菌群落结构与其他8个采样点的差异最大。进一步在属水平上对细菌群落组成进行成对比较，结果见表 3。LQ和LX样地的细菌群落组成与样地DS、DC、TB、ZQ和DB间存在显著或极显著的差异；样地DC的细菌群落组成与LC、LK、TB、LQ这4个样地存在显著差异；而样地LC的细菌群落组成则与样地ZQ和DB存在显著差异；样地LK与DB之间的细菌在属水平上也存在显著差异。

通过RDA分析，探明土壤环境因子与羊肚菌根际土壤细菌群落的相关关系，结果见图 5。第一、二排序轴累计解释率分别为55.6%和25.7%，累计解释率达到81.3%，说明第一、二排序轴能较好地反映出细菌群落与土壤理化性质及酶活性之间的相关关系。主要的细菌类群中，变形菌门、拟杆菌门和疣微菌门与土壤含水量、硝态氮、全氮、速效钾、全碳、有机质、铵态氮和海拔箭头方向相同，说明细菌群落与养分、土壤含水量及海拔呈正相关，而与pH、Ca、Mg含量箭头方向相反，呈负相关；放线菌门、酸杆菌门、扁平菌门与Mg含量、土壤脲酶和芳基硫酸酯酶箭头方向一致呈正相关，与Fe、Se、速效钾含量、土壤脱氢酶和碱性磷酸酶箭头方向相反，呈负相关；芽单胞菌门和绿弯菌门与土壤pH、Ca含量呈正相关，厚壁菌门与Fe、Se呈正相关。

3 讨论与结论 3.1 甘肃省羊肚菌根际土壤细菌组成多样性

在细菌门水平上，采样点DS、TB、LC、LK、ZQ、DB、LQ、LX的羊肚菌根际土壤细菌中变形菌门占比最高，其次为放线菌门和酸杆菌门，DC采样点中放线菌门的占比稍高于变形菌门。杨晓绒等^[11]在新疆伊犁昭苏县羊肚菌根际土壤微生物的研究中发现根际土壤中优势菌门也为变形菌门；变形菌门在土壤中广泛分布，是土壤细菌中丰度最大的细菌之一，变形菌门细菌具有多种代谢种类，是多种化学循环过程的参与者^[26]，其在羊肚菌根际土壤的化学循环中发挥一定的作用。放线菌门是荒漠类土壤的优势细菌门^[27]，DC采样点中放线菌门是其优势菌门。酸杆菌门作为土壤中参与大量关键物质循环的参与者，一些前人研究表明其受土壤pH的调控，与pH呈现负相关关系^[28]；但也有研究表明，酸杆菌门受pH的影响较小，而受土壤理化性质的影响较多^[29]。本研究中，除DC采样点外，pH值越低酸杆菌门丰度越高。在细菌科水平上，优势菌科为鞘藻科(Sphingomonadaceae) (19.35%)、酸性细菌_Gp6_未分类(Acidobacteria_Gp6_unclassified) (6.85%)、扁平菌科(Planctomycetaceae) (4.99%)，其优势菌科与熊川、杨晓绒等报道的优势菌科^{[9, 11]}有差异。从属水平来看，其优势菌属为鞘氨醇单胞菌属(Sphingomonas)、Gp6、Gp16、盖埃拉属(Gaiella)、嗜热芽孢杆菌属(Anoxybacillus)、单核杆菌属(Solirubrobacter)、发光杆菌属(Ilumatobacter)、芽孢杆菌属(Bacillus)、Gemmatimonas、诺卡氏菌属(Nocardioides)、假单胞菌属(Pseudomonas)，其优势菌属中，鞘氨醇单胞菌、芽孢杆菌、诺卡氏菌、假单胞菌均为固氮菌，固氮菌能够促进玉米等农作物和平菇等食用菌菌丝的生长，固氮菌可以固定分子态氮，能在生长过程中分泌吲哚乙酸、萘乙酸、赤霉素等生长激素及病原菌拮抗物质^[30-31]。鞘氨醇单胞菌属广泛分布于土壤中，是清理土壤中一些有毒物质的有效微生物类群之一，能在土壤中分泌糖类等营养物质，促进羊肚菌吸收^[32-33]。研究发现，假单胞菌属是双孢菇子实体发生所必需的环境微生物^[34]，该属的恶臭假单胞菌能促进羊肚菌菌核生成^[35]，可能对羊肚菌子实体的形成有一定影响。此外，假单胞菌属能够抑制土壤病原菌生长，并能降解环境中有毒有害物质^[36]，是有生物防治功能的重要的土壤细菌类群^[37]。从门、科、属中的unclassified bacterial class比例依次升高可见，羊肚菌根际土壤中仍存在大量未知的细菌群落，这与张婷等^[38]的研究一致。

3.2 土壤环境因子、酶活性与羊肚菌根际土壤细菌群落间的关系

研究表明，土壤微生物多样性及群落组成结构受土壤环境因子的影响显著^[39]，不同的细菌群落会受到一个或多个环境因子的影响。通过研究，我们发现羊肚菌根际土壤细菌菌群变形菌门、拟杆菌门和疣微菌门与土壤含水量、营养、海拔呈正相关，说明越是土壤含水量高、有机质及氮含量高的土壤，海拔越高越有利于这些细菌群落的生长；而pH、Ca和Mg的含量与这些细菌群落呈现负相关。野生羊肚菌每年发生的位置大体相同，目前北方羊肚菌种植过程中存在严重的连作障碍，羊肚菌的连作障碍机制无研究报道，推测与土壤中微量元素失衡、病原菌增加等有关^[40]。羊肚菌种植前的土壤需要使用生石灰去灭菌土壤，每亩地的石灰施用量多达100 kg，使土壤中的pH值升高、Ca和Mg含量增加，根据本研究的结果，pH、Ca和Mg的含量升高会使变形菌门、拟杆菌门和疣微菌门的菌群数量降低，栽培羊肚菌根际土壤中的情况需进行进一步的研究。放线菌门、酸杆菌门、扁平菌门与Mg含量呈正相关，与Fe、Se含量呈负相关；而厚壁菌门与Fe、Se含量呈正相关，说明微量元素对根际土壤细菌群落有影响，在一定程度上为人工种植羊肚菌过程中合理地添加一些微量元素、调节羊肚菌根际土壤中的菌群提供依据，这与何培新等^[40]的推测一致。

土壤酶活性对环境因子的变化反应敏捷，根际酶活性不仅受根际分泌物质的影响，还受到微生物活动的影响。在本研究中，我们发现放线菌门、酸杆菌门、扁平菌门与土壤脲酶和芳基硫酸酯酶呈正相关，与土壤脱氢酶和碱性磷酸酶呈负相关，厚壁菌门与土壤脱氢酶呈正相关。羊肚菌在生活史周期中向土壤环境中释放代谢产物，代谢产物影响羊肚菌根际土壤中的微生物群落，微生物群落的变化会导致土壤酶活性的变化，并反作用于羊肚菌，影响羊肚菌的发生。

因此，本研究通过羊肚菌根际土壤高通量测序，以及环境因子和酶活性对细菌群落的相互关系研究，揭示羊肚菌根际微生态系统各要素间的相互关系，并为羊肚菌的科学种植提供理论指导。