2022, Vol. 49扩展功能
文章信息
- 张雪, 范宝超, 赵永祥, 钱嘉莉, 王传红, 徐红, 郭容利, 李彬, 贾斌
- ZHANG Xue, FAN Baochao, ZHAO Yongxiang, QIAN Jiali, WANG Chuanhong, XU Hong, GUO Rongli, LI Bin, JIA Bin
- 基于CRISPR/Cas9系统筛选猪流行性腹泻病毒复制相关基因及其验证
- Screening and validation of porcine epidemic diarrhea virus replication-related genes based on genome-scale CRISPR/Cas9 system
- 微生物学通报, 2022, 49(12): 5138-5149
- Microbiology China, 2022, 49(12): 5138-5149
- DOI: 10.13344/j.microbiol.china.220895
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文章历史
- 收稿日期: 2022-09-14
- 接受日期: 2022-10-19
- 网络首发日期: 2022-11-02
2. 江苏省农业科学院兽医研究所, 江苏 南京 210014
2. Institute of Veterinary Medicine, Jiangsu Academy of Agricultural Sciences, Nanjing 210014, Jiangsu, China
CRISPR/Cas9系统是对基因组进行高效编辑的重要技术，其利用sgRNA的引导性和Cas9核酸酶的定点切割功能，可直接对编码区和非编码区精准打靶目的基因片段[1]。将CRISPR/Cas9基因编辑系统与全基因组筛选和后续的功能基因鉴定相结合，已成功应用于病毒感染必需基因的筛选研究中。例如，Ma等[2]利用CRISPR/Cas9系统发现了宿主基因EMC2、EMC3、SELIL、DERL2、UBE2G2、UBE2J1和HRDI对西尼罗病毒(west nile virus，WNV)诱导的细胞死亡具有重要的调控作用。Sun等[3]通过CRISPR基因组规模筛查表明，TMEM41B是猪传染性胃肠炎病毒(transmissible gastro enteritis virus，TGEV)和猪德尔塔冠状病毒(porcine deltacorona virus，PDCoV)等冠状病毒复制所必需的宿主因子，为深入研究基因功能及其在抗病中的作用奠定了重要基础。
猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus，PEDV)属冠状病毒科α冠状病毒属，可引起仔猪急性腹泻，具有高死亡率，给全国养猪业造成巨大经济损失。因此，开展PEDV复制相关基础研究具有重要意义。Xu等[4]研究发现，PEDV通过其核衣壳蛋白(N)与宿主转录因子Sp1结合能够抑制HDAC1的表达以促进PEDV的复制。石达[5]在研究宿主蛋白NPM1对病毒复制的作用中发现，受PEDV感染的细胞中NPM1蛋白表达显著上调，进一步研究发现N蛋白和NPM1蛋白相互作用能够上调细胞的抗凋亡能力，从而促进病毒的复制。目前虽已发现多种与PEDV复制相关宿主基因，但PEDV的受体仍未明确，而继续挖掘病毒复制相关基因，寻找与病毒复制相关的关键宿主因子，并通过抗病育种途径培育抗PEDV品种/品系猪，是从根本上抵御该病毒感染的重要途径。以CRISPR/Cas9高通量筛选策略为基础的分子设计育种能够实现畜禽抗病力的快速改良，现已广泛应用于遗传育种研究中，但针对PEDV的研究尚未见报道。前期研究证实，PEDV可有效感染人肝癌细胞系Huh-7[6]。为此，本研究基于CRISPR/Cas9系统构建Huh-7全基因组敲除文库，并结合高通量筛选全面系统地挖掘PEDV复制相关候选基因，以期为培育靶向性抗病品系提供科学参考和理论依据。
1 材料与方法 1.1 细胞和病毒人的全基因组CRISPR/Cas9 sgRNA质粒文库购自Addgene网站(Addgene #1000000048)；人胚胎肾细胞(HEK-293T)、人肝癌细胞(Huh-7)和猪小肠上皮细胞(IPEC-J2)由本实验室保存；猪流行性腹泻病毒株(AH2012/12)由本实验室分离并扩大培养(GenBank登录号为KU646831)。
1.2 主要试剂和仪器DMEM高糖培养基和胎牛血清及脂质体转染试剂盒LipofectimineTM 3000，Thermo Fisher公司；细胞基因组DNA提取试剂盒，天根生化科技(北京)有限公司；Premix Ex Taq Hot Start Version，TaKaRa公司；FastPure Cell/TissueTotal RNA Isolation Kit V2、Phanta Max Master Mix HiScript II 1st Strand cDNA Synthesis Kit和ChamQ SYBR qPCR Master Mix，南京诺唯赞生物科技有限公司；PEDV-N蛋白鼠单克隆抗体由本实验室保存；GAPDH兔多克隆抗体，Proteintech公司；ITGA11兔多克隆抗体，艾博抗(上海)贸易有限公司；RIPA (强)裂解液、HRP标记山羊抗鼠IgG (H+L)、HRP标记山羊抗兔IgG (H+L)和BCA蛋白定量试剂盒，碧云天生物技术公司；FITC Conjugated AffiniPure Goat Anti-mouse IgG (H+L)，武汉博士德生物工程有限公司；引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。
高速冷冻离心机，上海ScanSpeed公司；全自动化学发光图像分析系统，上海天能科技有限公司；荧光定量PCR仪，Thermo Fisher公司；酶标仪，Bio-Rad公司。
1.3 制备全基因组CRISPR/Cas9敲除细胞库 1.3.1 构建全基因组CRISPR/Cas9敲除质粒文库人的全基因组CRISPR/Cas9 sgRNA质粒文库由Sanjana等[7]提交至Addgene网站，针对人类19 050个基因设计共计123 411条sgRNA靶向序列，分为A库(65 383条sgRNA)和B库(58 028条sgRNA)。A文库和B文库都包含1 000个对照sgRNA，这些对照sgRNA不靶向任何基因组。利用高通量合成与克隆方法将A和B质粒文库连接至lentiCRISPRv2慢病毒表达载体(Addgene #52961)。
1.3.2 慢病毒包装及滴度测定取生长状态良好的HEK-293T细胞接种至10 cm细胞培养皿，当细胞汇合度达到80%−90%时将12 μg文库质粒、4 μg pMD2.G质粒和8 μg psPAX2质粒共转染于HEK-293T细胞中，6 h后更换为DMEM高糖完全培养基(体积分数10%胎牛血清)，继续培养60 h后收集病毒上清液，4 ℃、3 000 r/min离心10 min，将上清转移到新的离心管中，4 ℃、12 000 r/min离心30 min，然后用0.22 μm滤器过滤，分装后置于−80 ℃冰箱保存，同时进行慢病毒滴度测定。
1.3.3 慢病毒sgRNA文库感染Huh-7细胞系取生长状态良好的Huh-7细胞接种于10 cm细胞培养皿，待细胞融合度达到60%左右，按照感染复数(multiplicity of infection，MOI)=0.4感染3×107个Huh-7细胞进行慢病毒感染，同时感染上清液中加入8 μg/mL嘌呤霉素(puromycin)进行筛选，培养至12 h更换为正常培养基。为排除未感染细胞的影响，48 h后加入1 μg/mL的嘌呤霉素，连续筛选1周，得到全基因组敲除细胞库。
1.4 全基因组CRISPR/Cas9敲除细胞库验证利用PCR及DNA测序对全基因组CRISPR/Cas9敲除细胞库进行验证。收集全基因组CRISPR/Cas9敲除细胞并提取基因组DNA，针对lentiCRISPRv2载体区间序列设计引物，扩增区间包含sgRNA序列。引物序列为：F：5′-GAGGGCCTATTTCCCATGATTCC-3′；R：5′-CACGGCGACTACTGCACTTATATAC-3′。
以基因组DNA为模板进行PCR扩增。PCR反应体系：Premix Ex Taq Hot Start Version 25 μL，上、下游引物(1 μmol/L)各1 μL，模板1 μg，加ddH2O补足50 μL。PCR反应条件：94 ℃ 2 min；94 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，40个循环；72 ℃ 10 min。PCR扩增产物用1%琼脂糖凝胶电泳检测，并进行切胶回收，回收产物用于高通量测序。
1.5 利用全基因组CRISPR/Cas9敲除文库筛选PEDV复制相关基因Huh-7-Cas9-KO细胞以1×106个细胞铺于T25细胞培养瓶中，待细胞长满单层后，吸弃培养基并使用无菌PBS洗涤3次，加入含100 TCID50 PEDV变异株AH2012/12和3 μg/mL胰酶无血清培养基孵育细胞，37 ℃作用2 h后补充含2.5 μg/mL胰酶无血清培养基至7 mL，放回细胞培养箱(37 ℃、5% CO2)继续培养。同时设置Huh-7-Cas9-NC细胞为对照组，当对照组细胞全部死亡，收集敲除细胞组存活的细胞进行扩大培养。待细胞生长至一定数量后，再次以相同剂量PEDV AH2012/12病毒毒株进行感染，最终收集并扩增第3轮感染后存活细胞，经基因组DNA提取后送至苏州泓迅生物科技股份有限公司测序。利用MAGeCK Flute分析富集到的sgRNA reads进行排序绘制散点图，筛选出参与PEDV复制的关键宿主基因。
1.6 候选基因功能与通路富集分析采用DAVID数据库(https://david.ncifcrf.gov)对通过3轮PEDV筛选获得的sgRNA对应的靶基因按照pos|score排序，并以pos|p-value < 0.01、pos|lfc > 2为依据得到的120个候选基因进行基因本体(Gene Ontology，GO)富集分析和京都基因与基因组百科全书(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG)通路富集分析。利用R软件中GO plot包使GO富集结果可视化，最后使用ggplot2包绘制气泡图。
1.7 PEDV复制相关候选基因的验证由广州锐博生物科技有限公司设计并合成6个候选基因干扰片段(表 1)。将IPEC-J2细胞加入24孔细胞板，待细胞汇合度达70%时，更换新鲜的培养基(不含抗生素)，同时根据脂质体LipofectamineTM 3000说明书配制转染体系，siRNA终浓度为50 nmol/L，并逐滴加入培养板，在滴加的同时轻轻混匀培养基，置于细胞培养箱中培养24 h。
| Gene name | siRNA sequence (5′→3′) |
| ITGA11 | GCGAATACGTCCTGTAACA |
| RPA2 | GGCTTGTCCAAGACCTGAA |
| KIF2C | GACCTAGAGACCTTTGTGA |
| MCL1 | CAGTACGGATGGGTCACTA |
| PARP1 | GTGACTTTGCAGCAGAGTA |
| SLC18A1 | GTGTCTACACCGATGACCA |
取出细胞培养板，弃培养基并用无菌PBS洗涤3次，将PEDV AH2012/12病毒毒株以MOI=1的剂量接毒，每孔加入200 μL病毒和病毒维持液(含有5 μg/mL胰酶的无血清培养基)，吸附2 h后每孔补病毒维持液至500 μL，36 h后提取细胞总RNA和蛋白质。
实时定量PCR (real-time quantitatiove PCR，RT-qPCR)检测PEDV mRNA表达水平。细胞总RNA提取和cDNA合成参照FastPure Cell/Tissue Total RNA Isolation Kit V2及HiScript II Q RT SuperMix for qPCR (+gDNA wiper)反转录酶说明书进行，使用ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix试剂检测PEDV-N mRNA表达水平。引物序列为：PEDV-N-F：5′-CGCAAAGACTGAACCCACTAACTT-3′；PEDV-N-R：5′-TT GCCTCTGTTGTTACTCGGG GAT-3′。
Western blotting检测PEDV蛋白水平变化。取100 μg总蛋白加入5×载样缓冲液(loading buffer)，100 ℃变性8−10 min，瞬时离心后进行SDS-PAGE电泳，转膜封闭后分别加入ITGA11兔多抗(稀释度1:500)、PEDV-N鼠单抗(稀释度1:500)和内参抗体GAPDH (稀释度1:10 000) 4 ℃孵育过夜。使用PBST缓冲液清洗3次，每次30 min，加入相应二抗(稀释度1:10 000)，常温孵育1.5 h，PBST清洗3次，每次30 min，最后进行显色曝光。
1.8 ITGA11对PEDV复制的影响IPEC-J2细胞转染si-ITGA11 24 h后，将PEDV AH2012/12病毒毒株以MOI=1的剂量接毒。RT-qPCR检测ITGA11 mRNA表达水平，Western blotting检测ITGA11及PEDV蛋白水平变化，操作同1.7。
1.8.1 免疫荧光检测PEDV-N表达情况细胞感染PEDV 36 h后，加入预冷的无水乙醇，−20 ℃固定30 min；PBS清洗3次，5%脱脂奶粉室温封闭1 h；PBS清洗3次，加入一抗PEDV-N鼠单抗(稀释度1:500)，37 ℃孵育1 h；PBS清洗3次后，加入二抗FITC Conjugated AffiniPure Goat Anti-mouse IgG (H+L) (稀释度1:500)，37 ℃避光孵育30 min；PBS清洗3次后，加入DAPI染色剂(1:2 000)进行核染，室温避光孵育10 min；PBS清洗3次后，抗荧光淬灭剂封片，利用激光共聚焦显微镜观察绿色荧光数量及分布并拍照记录。
1.8.2 TCID50检测PEDV滴度水平将IPEC-J2细胞铺于96孔板，待细胞长满单层后吸弃培养基，使用无菌PBS洗3遍，将收获的病毒上清液于8 000 r/min离心5 min后用0.45 μm分子筛过滤，利用含5 μg/mL胰酶的高糖DMEM进行梯度稀释(10−1−10−8)，每个梯度设16个重复孔，同时设置不含病毒液细胞为阴性对照。每12 h观察记录细胞病变情况，6 d后统计病变细胞孔数，利用Reed-Muench两氏法计算病毒的半数组织培养感染剂量(tissue culture infective dose，TCID50)。
1.9 数据统计与分析使用SPSS 19.0对试验数据进行独立样本t检验分析，结果以“平均值±标准误”表示，应用GraphPad Prism 6.0软件对数据进行绘图。*：P < 0.05为差异显著；**：P < 0.01为差异极显著。
2 结果与分析 2.1 制备全基因组CRISPR/Cas9敲除细胞库人的全基因组CRISPR/Cas9 sgRNA质粒文库分为A库和B库，数量级约为1×105。为保证感染过程中sgRNA的丰度和分布均匀，参照Joung等[8]方法，成功制备滴度为1×107 TU/mL的慢病毒，随后按照0.4 MOI感染3×107个Huh-7细胞进行慢病毒感染，最终得到全基因组CRISPR/Cas9敲除细胞库。
为检测全基因组CRISPR/Cas9敲除细胞库是否构建成功，提取敲除细胞库基因组DNA，PCR扩增sgRNA区域。PCR产物直接测序显示在sgRNA序列区域，4种碱基信号值较接近，基本符合ATGC平均分配的原则。与来自Addgene网站的参考文库相比，质粒文库A和B分别含有98.64%和97.87%的sgRNA。由于sgRNA可能靶向细胞存活所必需的宿主基因或在细胞培养过程中丢失，因此，细胞文库A和B分别仅含有参考文库覆盖度的78.76%和75.54% (图 1)。随后，将细胞文库A和B合成为全基因组CRISPR/Cas9敲除细胞库，即具有足够覆盖sgRNA的文库，用于筛选PEDV复制相关基因。
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| 图 1 扩增质粒文库和细胞文库的覆盖率图 Figure 1 Coverage of amplified plasmid library and cell library. |
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通过MAGeCK Flute分析sgRNA reads的倍数变化进行排序绘制散点图(图 2)。结果显示，富集到排名前10的sgRNA对应的靶基因分别为FICD、MCL1、VAT1L、MT1X、MYO10、PARP1、ITGA11、ENTPD2、CCNT2和RPS27A。本次筛选中，富集到reads > 10 000的sgRNA有16个，reads > 1 000的sgRNA有20个。
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| 图 2 基因分布散点图 Figure 2 Scatter plot of the distribution of candidate genes. Huh-7-Cas9-KO细胞经3轮PEDV筛选富集到的sgRNA靶序列的频率和富集程度(PEDV感染组vs. mock组)；Log2 (fold change)为PEDV感染组与mock组标准化sgRNA计数之间的中值Log2比值 Scatter plot shows the frequencies and the enrichment degrees of sgRNA-targeted sequences enriched by three rounds of PEDV screening in Huh-7-Cas9-KO cells (mock-treated versus PEDV infected); Log2 (fold change) is the median Log2 ratio of normalized sgRNA count between PEDV challenged group and mock-treated populations. |
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通过DAVID数据库对候选基因进行GO和KEGG分析(图 3)。GO分析结果显示，这些靶基因主要参与的生物过程包括双键断裂修复、有丝分裂细胞周期负调控和程序性细胞凋亡等过程。利用KEGG通路数据库进行信号通路的富集，寻找所富集的信号通路，分析显示这些靶基因主要参与细胞凋亡、肿瘤转录调控和线粒体自噬等信号通路，以及富集程度较高、几乎所有肿瘤都会发生异常的细胞周期通路。
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| 图 3 候选基因GO和KEGG富集分析图 Figure 3 Enrichment analysis of candidate gene GO and KEGG. A：候选基因GO分析气泡图；B：候选基因KEGG富集分析气泡图 A: Bubble chart of candidate gene GO analysis; B: Bubble chart of candidate gene KEGG enrichment analysis. |
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由于筛选到多个候选基因参与细胞凋亡代谢过程，而且有研究表明它们能够介导肿瘤代谢及多种病毒的黏附和入侵[9-11]，因此选择了富集排名靠前的整合素α11 (integrin α11，ITGA11)、哺乳动物复制蛋白A2 (replication protein A2，RPA2)、驱动蛋白家族成员2A (kinesin family member 2A，KIF2A)、诱导髓系白血病细胞分化蛋白(induced myeloid leukemia cell differentiation protein 1，MCL1)、多聚ADP核糖化酶[poly (ADP-ribose) polymerase 1，PARP1]和囊泡单胺转运蛋白1 (vesicular monoamine transporter，SLC18A1)基因进行PEDV复制相关验证。结果显示，与无关对照si-NC相比，ITGA11基因在干扰后PEDV-N mRNA (图 4A)及蛋白(图 4B)水平显著降低(P < 0.01)，说明ITGA11基因可能为PEDV复制相关基因；干扰KIF2C、MCL1及SLC18A1基因后，PEDV的mRNA拷贝数及蛋白水平均有所下调，但差异不显著(P > 0.01)，而RPA2及PARP1在干扰后与对照组mRNA及蛋白水平无明显差异，说明二者可能并不直接参与PEDV在宿主细胞中的复制。
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| 图 4 PEDV复制相关候选基因的验证 Figure 4 Validation of candidate genes related to PEDV replication. A：候选基因转染干扰片段后对PEDV-N拷贝数变化；B：候选基因转染干扰片段后对PEDV-N蛋白变化；**：表示具有极显著差异(P < 0.01) A: Changes in the copy number of PEDV-N after candidate gene transfection with interference fragments; B: Changes in PEDV-N protein after candidate gene transfection with interference fragments; **: Significant difference (P < 0.01). |
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为进一步验证ITGA11对PEDV复制的影响，对猪源靶向细胞IPEC-J2细胞转染si-ITGA11后接毒，采用RT-qPCR测定ITGA11 mRNA相对表达量，Western blotting检测ITGA11和PEDV-N蛋白表达情况。结果显示，与si-NC相比，转染ITGA11干扰片段能显著降低ITGA11 mRNA表达量(P < 0.01) (图 5A)，并且有效减少ITGA11和PEDV-N的蛋白表达水平(图 5B)；同时，PEDV感染si-ITGA11组细胞中绿色荧光标记的量明显减少，表明干扰ITGA11可抑制PEDV的增殖(图 5C)。IPEC-J2细胞感染PEDV不同时间收集病毒液，使用Reed-Muench法测定子代病毒TCID50。结果如图 5D所示，与对照组相比，PEDV感染细胞24 h和36 h时子代病毒滴度显著下降，表明干扰ITGA11基因能够减少子代病毒颗粒的形成与释放，抑制PEDV在宿主细胞的复制，证实ITGA11具有促进PEDV复制作用。
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| 图 5 ITGA11促进PEDV的复制 Figure 5 Role of ITGA11 in promoting the replication of PEDV. A：转染si-ITGA11后接毒对ITGA11 mRNA表达的影响；B：转染si-ITGA11后接毒对ITGA11和PEDV-N蛋白的影响；C：转染si-ITGA11后接毒对PEDV-N的激光共聚焦观察；D：PEDV感染不同时间后子代病毒滴度测定；**：表示具有极显著差异(P < 0.01) A: Effect of transfection with si-ITGA11 followed by exposure on ITGA11 mRNA expression; B: Effect of transfection with si-ITGA11 followed by exposure on ITGA11 and PEDV-N protein; C: Confocal laser observation of PEDV-N after si-ITGA11 transfection; D: Detection of virus titer at different time intervals post infection with PEDV; **: Statistically significant difference (P < 0.01). |
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构建全基因组CRISPR/Cas9敲除细胞库时，物种的基因组注释是否完善对筛选的准确性十分重要，不完善的基因组注释会给sgRNA文库的设计带来很大困扰。与猪相比，人的基因组注释体系更加成熟，具有较为完善的sgRNA文库，能够大大节省科研时间精力。因此，本研究构建了人肝癌细胞Huh-7全基因组CRISPR/Cas9敲除细胞库，为重要表型筛选提供了技术支撑和筛选平台。为确保筛选的准确性，在设计sgRNA文库时，一个基因分别设计6条sgRNA，这大大降低了由于各种因素导致的基因组不稳定性和假阳性候选基因的产生[12-13]。然而，在整个筛选过程中，为扩大富集sgRNA的数量，需要对全基因组CRISPR/Cas9敲除细胞库进行传代操作，该过程会导致细胞丢失从而影响sgRNA的丰度，因此本研究得到的sgRNA敲除细胞库覆盖率低于80%。
2020年初，随着新型冠状病毒(corona virus disease-2019，COVID-19)将病毒性疾病带入公众视野，病毒性人畜共患病再次成为人们关注的焦点，研究病毒感染机制并发现病毒-宿主相互作用的新靶点将有助于开发新的抗病毒猪品种[14]。Zhang等[15]基于全基因组CRISPR/Cas9筛选验证了9个参与黄病毒感染的宿主基因，其中，内质网相关信号肽酶复合物(signal peptidase complex subunit，SPCS)基因敲除后可显著降低几乎所有黄病毒科病毒的复制水平。在丙型肝炎病毒(hepatitis c virus，HCV)研究中，CRISPR/ Cas9筛选到已报道的HCV入侵受体、RNA结合蛋白及代谢相关酶等多种宿主因子[16]，说明CRISPR/Cas9筛选具有较强的特异性及可靠性。本研究结合反向遗传筛选策略，利用PEDV感染Huh-7敲除细胞库，收集所有存活的细胞进行高通量测序，通过MAGeCK Flute分析富集到的sgRNA reads进行排序绘制散点图，最终筛选到参与PEDV复制的关键宿主基因。在所有的候选基因中，我们筛选到了2个已知病毒复制相关候选基因，即核蛋白基因RPS27a[9]和诱导髓系白血病细胞分化蛋白基因MCL1[10]，说明本筛选系统可信度较高。此外，我们也富集到参与肿瘤合成和代谢过程的重要基因，包括DNA拓扑异构酶II β结合蛋白1 (TopBP1)、RPA2、KIF2A、SLC18A1和ITGA11。(1) TopBP1在人和牛乳头瘤病毒基因组复制中起重要作用，其能够定位于离散的核病灶，并与乳头瘤病毒E2蛋白复合，在G1/S和早期S期被招募到病毒复制起点的区域[11]。(2) 尿嘧啶DNA糖基化酶与RPA复合物的p32亚基相互作用能够调节HIV-1逆转录从而促进病毒传播[17]，同时有研究通过COPD发现RPA2是参与COVID-19的关键基因[18]。(3) KIF2A是驱动蛋白家族成员之一[19-21]，吴炜等[22]研究报道，敲降KIF2A可抑制PI3K/AKT信号通路的激活，从而抑制结直肠癌细胞恶性增殖、迁移能力，促进其凋亡。(4) SLC18A1常见于结直肠癌中，可作为生物标志物[23]。(5) ITGA11是一种可识别胶原蛋白中GFOGER (O=羟脯氨酸)序列的胶原蛋白受体。有研究表明[24]，ITGA11在癌症相关成纤维细胞的促肿瘤发生亚型中显著上调。本文通过基因干扰和检测病毒效价等相关试验，初步验证ITGA11基因干扰后能够显著抑制PEDV的复制。另有研究报道[25]，I型干扰素能够诱导T98G细胞中ITGA11的mRNA及蛋白水平升高，说明ITGA11是一种新的干扰素刺激基因，但ITGA11是否通过调节I型干扰素进而影响PEDV的复制尚未见报道。本文首次利用全基因组CRISPR/Cas9文库方法筛选到ITGA11可能作为关键基因参与PEDV在宿主细胞中的复制。此外，由于受到候选基因干扰片段设计效果、转染条件及不同PEDV毒株的感染等影响，ITGA11是否为PEDV复制必需基因，以及该基因如何调控PEDV在宿主细胞的增殖仍需进一步研究。
综上所述，本研究通过全基因组CRISPR/ Cas9敲除文库发现ITGA11为PEDV复制相关基因，而且在干扰后能显著降低PEDV-N mRNA及蛋白质表达水平。上述研究表明，ITGA11基因可作为制备抗PEDV猪种的潜在靶基因。
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