2022, Vol. 49
表1(Table 1)
灵芝UDP-葡萄糖4-差向异构酶酶学性质研究及其应用
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文章信息
- 顾榕, 赵丽婷, 顾正华, 李由然, 石贵阳, 丁重阳
- GU Rong, ZHAO Liting, GU Zhenghua, LI Youran, SHI Guiyang, DING Zhongyang
- 灵芝UDP-葡萄糖4-差向异构酶酶学性质研究及其应用
- Expression and characterization of the UDP-glucose 4-epimerase from Ganoderma lingzhi
- 微生物学通报, 2022, 49(10): 4090-4103
- Microbiology China, 2022, 49(10): 4090-4103
- DOI: 10.13344/j.microbiol.china.220144
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文章历史
- 收稿日期: 2022-02-12
- 接受日期: 2022-03-28
- 网络首发日期: 2022-04-21
顾榕, 赵丽婷, 顾正华, 李由然, 石贵阳, 丁重阳. 灵芝UDP-葡萄糖4-差向异构酶酶学性质研究及其应用[J]. 微生物学通报, 2022, 49(10): 4090-4103.
GU Rong, ZHAO Liting, GU Zhenghua, LI Youran, SHI Guiyang, DING Zhongyang. Expression and characterization of the UDP-glucose 4-epimerase from Ganoderma lingzhi[J]. Microbiology China, 2022, 49(10): 4090-4103.
灵芝UDP-葡萄糖4-差向异构酶酶学性质研究及其应用
1. 江南大学粮食发酵与食品生物制造国家工程研究中心, 江苏 无锡 214122;
2. 江南大学江苏省生物活性制品加工工程技术研究中心, 江苏 无锡 214122
2. 江南大学江苏省生物活性制品加工工程技术研究中心, 江苏 无锡 214122
摘要: 【背景】 灵芝多糖是灵芝的重要活性物质之一。UDP-葡萄糖4-差向异构酶(UDP-glucose 4-epimerase，UGE，EC 5.1.3.2)是灵芝多糖合成途径中糖供体生成的重要酶，其参与了UDP-葡萄糖与UDP-半乳糖的相互转化，与多糖中半乳糖残基含量密切相关。【目的】 通过对来源于灵芝的UGE基因进行异源表达，丰富灵芝多糖糖供体合成途径重要酶的酶学特性信息，深入了解灵芝多糖代谢合成途径。【方法】 以灵芝菌株(Ganoderma lingzhi) CGMCC 5.26的cDNA为模板，克隆得到UGE基因GL30389，并在Escherichia coli BL21(DE3)中诱导表达，产物纯化后进行酶学性质、酶动力学、底物专一性及转化率的研究。【结果】 灵芝UGE的分子量为45 kDa。最适反应pH值为6.0，在pH 7.0−9.0范围内有较好的稳定性；最适反应温度为30 ℃，温度在40 ℃时稳定性最好。Fe2+和Mg2+对UGE有激活作用。以UDP-葡萄糖为底物时，Km为0.824 mmol/L，Vmax为769.230 μmol/(L·min)，kcat为1.333 s−1，kcat/Km为1.618 L/(mmol·s)。灵芝UGE对D-葡萄糖、半乳糖醛酸及N-乙酰葡萄糖胺有催化活性。通过优化pH、温度、底物与酶的配比、添加金属离子将转化率从16.0%提升至39.4%。【结论】 灵芝UGE与植物来源的UGE酶学性质较为相似，其催化效率优于大部分细菌来源的UGE。本研究丰富了灵芝多糖糖供体合成途径重要酶的酶学特性信息，有利于深入了解灵芝多糖代谢合成途径。
关键词:
灵芝 UDP-葡萄糖4-差向异构酶 酶学性质 底物专一性 转化率
Expression and characterization of the UDP-glucose 4-epimerase from Ganoderma lingzhi
1. National Engineering Research Center for Cereal Fermentation and Food Biomanufacturing, Jiangnan University, Wuxi 214122, Jiangsu, China;
2. Jiangsu Provincial Engineering Research Center for Bioactive Product Processing, Jiangnan University, Wuxi 214122, Jiangsu, China
2. Jiangsu Provincial Engineering Research Center for Bioactive Product Processing, Jiangnan University, Wuxi 214122, Jiangsu, China
Abstract: [Background] Ganoderma lingzhi polysaccharides (GLP) are the main active component of this mushroom. UDP-glucose 4-epimerase (UGE, EC 5.1.3.2), an essential enzyme in the generation of sugar donor in synthesis of GLP, catalyzes the interconversion of UDP-glucose and UDP-galactose and thus is closely related to the content of galactose residue in GLP. [Objective] Through heterogeneous expression of the UGE gene from G. lingzhi, this study aims to further explore the enzymatic properties of important enzymes in the generation of sugar donor in GLP synthesis and gain a clearer insight into the synthesis pathway of GLP. [Methods] With the cDNA of G. lingzhi CGMCC 5.26 as template, UGE gene was cloned and then expressed in Escherichia coli BL21(DE3). The yielded recombinant enzyme was then purified and the enzymatic properties and kinetics, substrate specificity, and conversion rate of the purified enzymes were investigated. [Results] The recombinant enzyme was 45 kDa. The optimum reaction pH was 6.0, and it was stable at pH 7.0−9.0. The optimum temperature was 30 ℃, and it was most stable at 40 ℃. Fe2+ and Mg2+ could activate UGE. With UDP-glucose as substrate, the enzyme had the Km of 0.824 mmol/L, Vmax of 769.230 μmol/(L·min), kcat of 1.333 s−1, and kcat/Km of 1.618 L/(mmol·s). It catalyzed D-glucose, galacturonic acid, and N-acetylglucosamine. The conversion rate was increased from 16.0% to 39.4% at the optimal pH, temperature, and ratio of substrate with the addition of metal ions. [Conclusion] UGE from G. lingzhi has similar enzymatic properties to plants-derived UGE, and the catalytic efficiency was higher than most of the UGEs from bacteria. This study enriches the enzymatic properties of important enzymes involved the sugar donor synthesis in GLP production, which helps enhance the understanding of GLP synthesis pathway.
Keywords:
Ganoderma lingzhi UDP-glucose 4-epimerase enzymatic properties substrate specificity conversion rate
灵芝隶属于担子菌门伞菌纲多孔菌目灵芝科灵芝属，是一种食用药物真菌，最早记载于汉代的《神农百草经》中，具有很高的药用价值和营养价值[1]。
灵芝多糖是灵芝的重要活性物质之一，目前人们已分离出200多种灵芝多糖[2]。灵芝多糖是一种大分子化合物，多为杂多糖，具有抗氧化、抗肿瘤、免疫调节及调节肠道菌群等多种生物活性[2]。灵芝多糖的常见单糖组分为葡萄糖、半乳糖、甘露糖。其中葡萄糖占主要部分，半乳糖的比例为1%−10%[3]。因此，对UDP-半乳糖的合成途径及其相关酶的研究能对灵芝多糖生物合成途径有更深入的理解。
UDP-葡萄糖4-差向异构酶(UDP-glucose 4-epimerase，UGE)作为灵芝多糖前体合成的重要酶，参与了UDP-葡萄糖与UDP-半乳糖之间的相互转化(图 1)[4]。研究表明UGE能平衡和调节核苷酸糖的水平[5-7]，这对多糖中单糖组成比例的变化与调控也具有潜在的影响。目前关于UGE的研究主要集中在细菌、植物来源，在食用药物真菌中的报道较少，尚无关于灵芝来源UGE的相关研究。本文对来源于灵芝的UGE基因进行挖掘和异源表达，通过对酶学性质、酶动力学等方面的分析，以期进一步丰富此类酶的酶学特性信息，同时加深对灵芝多糖代谢合成途径的了解。
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| 图 1 UGE介导的UDP-葡萄糖与UDP-半乳糖的可逆反应 Figure 1 UGE-mediated reversible reaction of UDP-glucose with UDP-galactose. |
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大肠杆菌(Escherichia coli) JM109、大肠杆菌表达宿主BL21(DE3)和高效非融合、可溶的pTIG-Trx表达载体由本实验室保藏。灵芝菌株CGMCC 5.26购自中国普通微生物菌种保藏管理中心(China General Microbiological Culture Collection Center，CGMCC)，由本实验室保藏。
LB培养基(g/L)：蛋白胨10.0，氯化钠10.0，酵母提取物5.0。
TB培养基(g/L)：酵母提取物24.0，蛋白胨12.0，磷酸氢二钾9.4，磷酸二氢钾2.2，甘油8 mL。
1.1.2 主要试剂和仪器UDP-葡萄糖，上海源叶生物科技有限公司；UDP-半乳糖及其他单糖，上海麦克林生化科技有限公司。酶标仪，TECAN公司；台式高速离心机，Sigma-Aldrich上海贸易有限公司；PCR仪和核酸凝胶电泳仪，Bio-Rad公司；蛋白纯化仪，苏州赛谱仪器有限公司。
1.2 方法 1.2.1 灵芝UGE基因的挖掘在NCBI网站获取灵芝全基因组cDNA的核苷酸序列。在KEGG网站检索“GalE”，获取该酶的EC编号。采取全基因功能注释法，通过全基因组序列比对，找出不同物种间的相似区域，再利用EC编号搜索特定功能的基因，实现基因的挖掘。具体流程如下：选择KEGG Automatic Annotation Server (KAAS)网站(http://www.genome.jp/tools/kaas/)上Complete or Draft Genome的KAAS job request (BBH method，双向最佳匹配法)功能。输入灵芝全基因组序列，assignment method选择BBH，并从selected organisms中选择40种真菌来源的生物进行比对(与灵芝来源相近)，点击compute，得到基因ID号-KO编号的表格。再与从KEGG下载的KO编号-EC编号表进行比对，对应得到基因ID号-EC编号的表格，找到EC编号为5.1.3.2 (UGE)对应的基因ID号。
1.2.2 灵芝RNA的提取及灵芝UGE基因的扩增提取灵芝RNA，将其反转录为cDNA作为扩增模板。利用软件CmSuite8设计目的基因UGE的上游引物F (5′-CGGAATTCTAATGTCGG AACTCAAACGAGTG-3′)和下游引物R (5′-CC AAGCTTGTCGGTATCGTACCCCTTGG-3′)，在上、下游引物5′-端分别加入EcoR I和Hind III酶切位点，并添加保护碱基。扩增得到GL30389基因。
1.2.3 重组菌的构建和筛选将扩增得到的UGE基因GL30389切胶回收并纯化。利用EcoR I和Hind III内切酶对胶回收后的UGE基因片段和pTIG表达质粒进行双酶切，连接后构建重组质粒pTIG-UGE。将重组质粒转化至E. coli JM109感受态中，提取质粒双酶切，测序验证正确后转化至E. coli BL21(DE3)中表达，培养1 h后将重组菌pTIG- UGE/BL21(DE3)、对照菌pTIG/BL21(DE3)分别涂布于100 mg/L的Amp抗性平板上，37 ℃倒置培养12 h，挑取单菌落进行菌落PCR验证，再将条带大小与目的条带理论长度相近的转化子送公司测序，筛选出阳性转化子。
1.2.4 灵芝UGE基因在大肠杆菌BL21(DE3)中的诱导表达挑取测序正确的重组pTIG-UGE单菌落及pTIG空质粒(对照)接种于20 mL的LB液体培养基中，在37 ℃、200 r/min的条件下培养12 h，再以2%的转接量转接至50 mL的TB培养基中，37 ℃、200 r/min培养至OD600为0.6−0.8时，添加终浓度为0.1 mmol/L的IPTG诱导表达，在16 ℃、200 r/min条件下诱导24 h，4 ℃、12 000 r/min条件下离心10 min，弃上清收集菌体。用Tris-HCl (pH 8.0)洗涤菌体3次。最后加入适量的Tris-HCl缓冲液，在功率为300 W、工作时间8 min、工作1 s停2 s的超声条件下破碎，4 ℃、12 000 r/min条件下离心10 min，弃不溶细胞碎片，上清液用0.45 μm微孔滤膜过滤，得到粗酶液。
1.2.5 酶活力的检测采用高效液相色谱法[8]测定底物UDP-葡萄糖和产物UDP-半乳糖含量，计算酶活力。高效液相色谱条件：Dionex CarboPac PA10色谱柱；Dionex CarboPac PA10保护柱；柱温30 ℃；流速1 mL/min；进样量25 μL。流动相为2 mmol/L NaOH溶液与1 mol/L NaAc溶液。检测器为紫外可见光检测器；检测波长为262 nm。
酶活测定体系：130 μL UDP-葡萄糖(终浓度为1 mg/mL)，20 μL纯酶液(终浓度为0.5 mg/mL)，总体积为150 μL。
反应条件：在30 ℃下孵育10 min，通过煮沸5 min终止反应。
酶活定义：一个酶活力单位(1 U)定义为温度为30 ℃和pH 8.0条件下，在1 min内转化1 μmol底物UDP-葡萄糖所需的酶量。
1.2.6 蛋白纯化及其分析利用镍柱对pTIG-UGE的粗酶液进行纯化，收集纯化后的酶液，经超滤管浓缩处理后，使用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰氨凝胶电泳(SDS-PAGE)对其进行鉴定。
1.2.7 酶学性质反应体系均为纯酶20 μL，Tris-HCl缓冲溶液100 μL (pH 8.0)，底物UDP-葡萄糖(1 mg/mL) 80 μL。反应条件为30 ℃反应10 min，每个条件设置3个平行。
(1) UGE的最适反应pH及pH的稳定性：测定相同温度、不同pH条件下UGE纯酶的酶活力。将最高酶活力设为100%，计算出不同pH条件下的相对酶活。测定相同温度不同pH条件下孵育1 h后的残余酶活力，以最高酶活力设为100%，计算不同pH条件下的残余酶活，探究pH稳定性。
(2) UGE的最适反应温度及温度稳定性：测定最适pH时不同温度条件下UGE纯酶的酶活力。将最高酶活力设为100%，同上述方法探究温度稳定性。
(3) 金属离子、有机溶剂、抑制剂对酶活的影响：测定最适pH、温度时添加不同金属离子、有机溶剂、抑制剂后的酶活力。将不添加金属离子、有机溶剂、抑制剂的样品作为对照组，酶活设为100%。根据酶活力倍数计算出实验组的相对酶活。
(4) 动力学相关常数测定：测定最适反应条件时不同底物(UDP-葡萄糖)浓度下UGE的酶活力，并对应计算反应速率。以底物浓度(S)为X轴，反应速率(V)为Y轴，作出反应速率随底物浓度变化的曲线。使用双倒数法，作出1/V随1/S变化的线性图。根据截距与斜率，计算UGE的Km、kcat、Vmax及kcat/Km值。
1.2.8 底物专一性研究分别将D-葡萄糖、D-半乳糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸、D-阿拉伯糖、D-木糖、N-乙酰葡萄糖胺和N-乙酰半乳糖胺作为反应底物，体系同上。条件为30 ℃反应10 min，通过高效液相色谱对底物与产物进行定量测定。
1.2.9 提高反应转化率的研究(1) pH和温度对酶反应转化率的影响：在不同pH (根据最适反应pH及pH稳定性)和不同温度(根据最适反应温度及温度稳定性)条件下，分别测定随着反应时间的延长生成物浓度的变化，分析pH和温度对酶反应热力学的影响。
(2) 最适金属离子浓度测定：根据酶学性质中不同金属离子对酶活力的影响，选取对酶活力有促进作用的金属离子。添加不同浓度的金属离子，根据转化率判断有促进作用金属离子对酶转化率的最适浓度。
(3) 底物与酶浓度对酶转化率的影响：利用控制变量法，分别测定一定时间内不同底物浓度、酶浓度、底物/酶配比条件下反应的转化率，寻找最优的底物浓度和酶浓度条件。
2 结果与分析 2.1 灵芝UGE基因的克隆及重组菌的获得采取全基因注释法对灵芝全基因组cDNA进行注释，最终得到一条基因序列GL30389。该基因全长为1 119 bp，编码372个氨基酸，理论分子量为41 kDa。将基因片段pTIG-GL30389与pTIG表达载体连接后构建重组质粒pTIG-UGE (图 2)，转化至E. coli后挑取单菌落进行菌落PCR验证(图 3)，测序筛选阳性转化子，成功得到重组质粒pTIG-UGE。
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| 图 2 pTIG-UGE重组质粒构建图谱 Figure 2 Construction map of pTIG-UGE recombinant plasmid. |
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| 图 3 重组菌菌落PCR鉴定电泳结果 Figure 3 Recombinant bacteria colony PCR identification electrophoresis results. M：DNA Marker；1−4：重组菌pTIG-GL30389菌落PCR产物 M: DNA Marker; 1−4: PCR product of recombinant bacteria pTIG-GL30389 colony. |
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将重组菌株pTIG-UGE(BL21)经IPTG诱导表达目的蛋白UGE，得到粗酶液。使用镍柱对粗酶液进行纯化。如图 4所示，1、2均为pTIG-GL30389粗酶液经过镍柱纯化后的酶液，在45 kDa处有明显的重组蛋白条带，条带清晰且无杂带，与理论条带分子量大小加上His标签的蛋白分子量(42.5 kDa)相似，证明成功表达。经过镍柱纯化后酶液的比酶活为0.7 U/mg。
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| 图 4 GL30389蛋白纯化电泳图 Figure 4 Electropherogram of GL30389 protein purification. |
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如图 5所示，UGE的最适反应pH值为6.0，该条件下保温1 h剩余酶活为70%。该酶在酸性环境下酶活力较高且稳定；碱性环境下酶活力较低，但pH值在7.0−9.0时稳定性高于酸性条件。这表明该酶pH耐受范围较广，既耐酸也耐碱。不同来源UGE的最适pH值集中在7.0−9.0之间，pH值也是在7.0−9.0之间稳定性最优。灵芝UGE的最适pH与其他来源相比偏小，具有更强的耐酸能力。稳定性在pH 8.0时最优。
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| 图 5 pH对酶活力的影响及稳定性的研究 Figure 5 Effect of pH on enzyme activity and stability. A：UGE的最适pH；B：UGE的pH稳定性 A: Optimum pH of UGE; B: pH stability of UGE. |
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如图 6所示，UGE的最适反应温度是30 ℃。当温度小于30 ℃时相对酶活随着温度的降低而减小，当温度为20 ℃时，相对酶活仍保持在70%以上；当温度大于30 ℃时，相对酶活随着温度的升高而减小；当温度升高到60 ℃时，相对酶活依旧能保持在50%以上。
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| 图 6 温度对酶活力的影响及稳定性的研究 Figure 6 Effect of temperature on enzyme activity and stability. A：UGE的最适温度；B：UGE的温度稳定性 A: Optimum temperature of UGE; B: Temperature stability of UGE. |
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UGE在不同温度下保温1 h后测定的剩余酶活如图 6B所示。UGE在35−40 ℃时最为稳定，当温度低于40 ℃时，相对酶活随着温度的降低逐渐减小；当温度为20 ℃时，相对酶活还能保持在65%以上；当温度高于40 ℃时，相对酶活随着温度的升高而降低，但是相对酶活在60 ℃时仍能保持在55%以上。
对不同来源UGE酶学性质的比较显示，动物、细菌来源的最适温度会略高于植物来源，部分嗜热菌的最适温度明显高于此范围。灵芝UGE的最适温度和温度稳定性较符合植物来源UGE的特性。
2.3.3 金属离子及有机溶剂对酶活性的影响不同金属离子对UGE活性的影响各不相同，不同浓度的金属离子对UGE活性的影响也有很大差异。如图 7A所示，低浓度的Fe2+、Mg2+可提高UGE的酶活力，而其他金属离子均会抑制酶活力，其中Cu2+抑制作用最明显，而且Cu2+浓度越高，抑制能力越强，Mn2+、Na+、K+及低浓度的Ni2+、Co2+、Fe3+、Al3+对酶的抑制作用不明显。
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| 图 7 金属离子及有机溶剂对酶活力的影响 Figure 7 Effect of metal ions and organic solvents on enzyme activity. A：金属离子对酶活力的影响；B：有机溶剂对酶活力的影响 A: Effect of metal ions on UGE; B: Effect of organic solvents on UGE. |
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如图 7B所示，当加入5%的正丙醇和甲醇时，酶活高于对照组，而其他有机试剂均对酶活力有抑制作用，但抑制作用不明显，说明UGE对有机试剂耐受力较强。
2.3.4 抑制剂对酶活性的影响如图 8所示，当加入0.1 mmol/L的二硫苏糖醇(dithiothreitol，DTT)、乙二胺四乙酸(ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA)、苯甲基磺酰氟(phenylmethanesulfonyl fluoride，PMSF)，相对酶活还能保持在80%以上；当加入0.5 mmol/L DTT、EDTA和PMSF时，相对酶活下降至50%以下。说明较高浓度的DTT和EDTA对酶活损害较大。
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| 图 8 抑制剂对酶活力的影响 Figure 8 Effect of inhibitors on enzyme activity. |
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根据计算得出UGE的米氏常数Km为0.824 mmol/L，反应最大速率Vmax为769.230 μmol/(L·min)，催化常数kcat为1.333 s−1，催化效率指数kcat/Km为1.618 L/(mmol·s)。水稻(Oryza sativa var. Nipponbare)[9]、拟南芥(Arabidopsis thaliana)[10]、蕨类(Davallia divaricate)[11]、豌豆(Pisum sativum L. cv. Wando)[12]等植物来源的UGE普遍比细菌来源的UGE对底物(UDP-葡萄糖或UDP-半乳糖)的亲和力高。灵芝UGE对UDP-葡萄糖的亲和力与拟南芥(Arabidopsis thaliana)相近[10]，稍低于其他植物来源的UGE，但相较于大部分细菌具有更高的亲和性。
2.4 底物专一性探究研究表明UGE对部分游离单糖，如D-葡萄糖、D-半乳糖、D-果糖和D-塔罗糖等也有催化能力，酶活性一般介于0.3−9.7 nmol/(mg·min)[13]。该酶的底物广谱性研究结果表明UGE对D-半乳糖、葡萄糖醛酸、N-乙酰半乳糖胺、D-阿拉伯糖、D-木糖无催化能力，对D-葡萄糖、半乳糖醛酸、N-乙酰葡萄糖胺有催化能力。其中以N-乙酰葡萄糖胺为底物，反应10 min的转化率为1.9%。
2.5 提高UGE反应转化率的研究 2.5.1 pH和温度对UGE反应热力学的影响pH和温度是UGE反应热力学的重要因素，会影响UGE反应的转化率。根据酶学性质中UGE反应的最适pH值为6.0，pH 8.0时稳定性最优，因此，将pH 6.0、7.0、8.0对反应热力学的影响展开研究。由图 9可知，pH改变影响了酶促反应的平衡常数。pH从6.0提升至8.0，转化率从16.0%提高到了22.4%。
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| 图 9 pH (A)和温度(B)对UGE反应热力学的影响 Figure 9 Effect of pH (A) and temperature (B) on thermodynamics of UGE reaction. |
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根据酶学性质对30、40、50 ℃展开研究。温度为30 ℃时达到平衡状态的时间最快，约4 h达到平衡，而且2 h的转化率为27.3%，远高于35 ℃和40 ℃；35 ℃达到平衡状态的时间次之，40 ℃达到平衡状态的时间最长。因此pH 8.0、30 ℃是转化的最优条件，此时的转化率能提升为30.9%。
2.5.2 金属离子浓度对转化率的影响因为酶学性质中Mg2+与Fe2+可提高UGE的酶活力，所以开展了这2种金属离子对酶转化率影响的研究。由图 10可知，随着Mg2+浓度的增加，转化率逐渐降低。低浓度的Fe2+可提高转化率，而高浓度的Fe2+则会显著抑制酶的活性。最适的Fe2+添加浓度为0.05 mmol/L，最终转化率可以提升至35.4%。
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| 图 10 Fe2+ (A)和Mg2+ (B)对UGE反应转化率的影响 Figure 10 Effect of Fe2+ (A) and Mg2+ (B) on the conversion rate of UGE reaction. |
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由表 1得知，在一定的反应时间内，底物浓度相同时，酶浓度越高，底物/酶的比值就越低，转化率越高；酶浓度相同时，底物浓度越高，底物/酶的比值越低，转化率越高；当底物浓度为4.4 mg/mL，酶浓度为2.6 mg/mL时，转化率能达到最高，为39.4%。
表 1 底物浓度、酶浓度对转化率的影响
Table 1 Effect of substrate concentration and enzyme concentration on conversion rate
| Entry | Substrate (mg/mL) | Biocatalyst (mg/mL) | S/C (g/g) | Conversion (%) |
| 1 | 2.2 | 0.3 | 7.3 | 22.5 |
| 2 | 2.2 | 0.6 | 3.7 | 25.5 |
| 3 | 2.2 | 1.2 | 1.8 | 35.4 |
| 4 | 4.4 | 0.6 | 7.3 | 25.6 |
| 5 | 4.4 | 1.2 | 3.7 | 26.7 |
| 6 | 4.4 | 2.6 | 1.8 | 39.4 |
| 7 | 1.1 | 0.3 | 3.7 | 25.7 |
| 8 | 0.5 | 0.3 | 1.8 | 26.1 |
目前关于UGE的研究主要集中在细菌、植物来源，对食用药物真菌的报道较少，尚无关于灵芝来源UGE的相关研究。灵芝UGE的最适pH值为6.0，pH 8.0时最为稳定。通过表 2可知，UGE的最适pH值范围为7.0−9.0，物种之间差异性不大。灵芝UGE的最适pH值偏低，具有更强的耐酸能力，与Pyrococcus horikoshii[26] (pH 6.5)相近，低于大部分的植物、动物、细菌来源的UGE。pH会改变底物与酶的带电状态，影响酶与底物的特异性结合，从而改变酶活性及其稳定性。底物和酶分子在最适条件下最易结合，酶活力及酶稳定性最好；底物和酶分子在其他条件下的结合能力下降，从而降低了酶活力和酶稳定性[29]。
表 2 不同来源UGE的动力学参数及酶学信息
Table 2 Kinetic parameters and enzymatic information of UGE from different sources
| Sources | Species | Substrate | Km (mmol/L) | Vm (mmol/(L·min)) | kcat (min−1) | Optimum pH | Optimum temperature (℃) |
| Plants/ rice |
Oryza sativa var. Nipponbare[9] | UDP-Gal | 0.40; 3.20 | ||||
| Arabidopsis thaliana[10] | UDP-Glc | 0.76 | 7.0−9.0 | 30−40 | |||
| Davallia divaricate[11] | UDP-Glc | 0.55; 0.79 | 6.82×10−9; 14.96×10−9 | 10.2; 22.2 | 8.5 | 30−40 | |
| UDP-Gal | 0.03; 0.06 | 3.86×10−9; 10.71×10−9 | 6; 16.2 | 10−40 | |||
| Pisum sativum L. cv. Wando[12] | UDP-Glc | 0.31 | 8.5 | 30−40 | |||
| UDP-Gal | 0.29 | ||||||
| UDP-Ara | 0.16 | ||||||
| UDP-Xyl | 0.15 | ||||||
| Vicia faba L.[14] | UDP-Glc | 0.25 | 9.5 | ||||
| UDP-Gal | 0.12 | ||||||
| Animals | Oyster Magallana gigas[15] | UDP-Gal | 1.60 | 0.27 | 134 | 8.5 | 16−40 |
| Trypanosoma cruzi[16] | UDP-Gal | 0.114 | |||||
| Capra hircus[17] | UDP-Gal | 0.021 | 2.44 | 8.0 | 40 | ||
| Human[18] | UDP-Glc | 9.5 | 37 | ||||
| Bacteria | Marinitoga piezophila KA3[19] | UDP-Glc | 0.76 | 1.19×10−8 | 8.0 | 35−45 | |
| Canmpylobacter jejuni[20] | UDP-Glc | 0.78 | 9.5 | ||||
| E. coli O86[21] | UDP-Glc | 0.37 | |||||
| E. coli ER2566[22] | UDP-Glc | 237 | 0.33 | ||||
| E. coli K12[23] | UDP-Glc | 1.20 | 1 080 | 7.0 | 35 | ||
| Pyrobaculum calidifontis[24] | UDP-Gal | 3.90 | 50.4 | 7.0 | 90 | ||
| Thermus spp.[25] | UDP-Gal | 0.258 | 3.319 | 9.0 | 50 | ||
| Pyrococcus horikoshii[26] | UDP-Gal | 0.40 | 6.5 | 65 | |||
| UDP-Glc | 1.20 | ||||||
| Aeromonas hydrophila[27] | UDP-Gal | 0.70 | 1 728 | 8.0−9.0 | 37 | ||
| Bacillus anthracis[8] | UDP-GlcNac | 8.0 | 37 | ||||
| Bifidobacterium bifidum[28] | UDP-Glc | 1.40 | 0.17 | 9.0 | 37 | ||
| UDP-Gal | 0.54 | 0.18 |
灵芝UGE最适温度为30 ℃，较为接近植物来源UGE，略低于动物、细菌来源，而灵芝液态发酵温度通常也控制在30 ℃最为适宜。当温度高于30 ℃时，相对酶活随着温度的升高而迅速降低，但是相对酶活在60 ℃时仍能保持在55%以上，而热荚硫细菌(Marinitoga piezophila)[19]、人体红细胞[18]、蕨类(Davallia divaricate)[11]来源的UGE在60 ℃时已变性失活，表明灵芝UGE的耐高温能力较好。灵芝UGE在温度为40 ℃时稳定性最好，在35−45 ℃条件下保温1 h相对酶活均维持在90%以上，在60 ℃时相对酶活仍能保持在60%左右，表明该酶的热稳定性较好，有利于应用于大规模的工业化生产中。生产过程中热量不断积累会造成反应体系温度升高，灵芝UGE则可降低热量因素导致的酶活力降低及失活的影响。
低浓度的Fe2+、Mg2+可提高灵芝UGE的酶活力，因为这2种金属离子与UGE酶、UDP-葡萄糖形成了特殊的三元复合物，它们的存在有利于酶蛋白与底物的特异性结合，从而提高了催化活性[29]。然而其他金属离子均会抑制灵芝UGE的酶活力，其中Cu2+抑制能力最强，浓度很低时也会导致相对酶活的大幅下降，可能是Cu2+与UGE酶中的氨基、吲哚基或者巯基结合，影响了其活性中心的结构。金属离子对不同来源UGE酶活力的影响也不相同，Ca2+、Mg2+、Mn2+对热荚硫UGE有激活作用[19]，Ca2+、Mg2+对蕨类UGE有轻微的激活作用[11]。其中Mg2+对UGE的激活作用最常见，可能是由于差向异构化采取的是质子转移机制，这一机制认为半径≤0.08 nm的二价金属离子对活性中心有稳定作用，而半径 > 0.08 nm的二价金属离子对酶活性有抑制作用。二价金属离子与酶结合后，活性部位(疏水区)外露，离子半径越小，水合离子半径越大，越不易钻入到酶的凹陷区域，底物则更容易与酶结合[30-31]。
灵芝UGE的Km为0.824 mmol/L，Vmax为769.230 μmol/(L·min)，kcat为1.333 s−1，kcat/Km为1.618 L/(mmol·s)，与植物来源的酶相近。不同来源UGE的Km值存在较大差异，植物来源的Km值明显低于细菌来源。米氏常数Km值越小，酶与底物的亲和能力越强；Km值越大，亲和能力越弱。本研究中灵芝UGE的Km与拟南芥(Arabidopsis thaliana)[10]较为相似，对UDP-葡萄糖的亲和力高于大部分细菌来源的UGE；kcat为79.980 min−1，其对底物的催化效率较高，优于大部分细菌来源的UGE。灵芝UGE对D-半乳糖、葡萄糖醛酸、N-乙酰半乳糖胺、D-阿拉伯糖、D-木糖无催化能力，对D-葡萄糖、半乳糖醛酸、N-乙酰葡萄糖胺有催化能力。其中以N-乙酰葡萄糖胺为底物，反应10 min的转化率为1.9%。然而大肠杆菌[13]来源的UGE对D-葡萄糖、D-半乳糖、D-果糖、D-塔格糖、D-山梨糖、D-阿洛酮糖等底物均有催化活性，较灵芝UGE表现出更强的底物广谱性；其他细菌如热荚硫细菌(Marinitoga piezophila)[19]对于游离的单糖均无催化活性。
目前国内外对UGE的研究主要集中在底物特异性、过表达对生长的影响及分子改造上，有关UDP-葡萄糖催化生成UDP-半乳糖转化率的研究较少。文献报道的大肠杆菌来源的UDP-葡萄糖生成UDP-半乳糖的转化率约为22.0%[23, 32]，本文发现金属离子Fe2+对纯化的UDP-葡萄糖4-差向异构酶有激活作用，通过pH、温度、金属离子添加、底物/酶的配比优化反应体系，即最佳反应条件为pH 8.0、温度30 ℃、添加0.05 mmol/L Fe2+且底物/酶为1.8时，将转化率从初始的16.0%提升至39.4%。本研究了解了灵芝UGE的酶学信息及灵芝多糖合成途径，为进一步明确UGE在灵芝多糖发酵过程对单糖组成比例的调控机制提供了理论依据。后续研究中，通过构建灵芝UGE敲除和过表达重组菌株，分析其液态发酵过程中多糖产量、单糖组成等性质的变化，可深入探究UGE对单糖组成比例的调控规律和影响机制。
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