葡萄的生长发育过程依赖于葡萄园的生态系统，其生物多样性对葡萄的生理生态有重要影响。葡萄生态系统的组成包括葡萄园土壤、葡萄植株、园内覆盖的其他植物、有益昆虫等小动物以及各种微生物群体，构成复杂且动态的种间生态网络^[1]。在自然状态下，葡萄生态系统中生物多样性的相互作用能够增强植株自身的免疫力和对环境的适应性和抗性，有利于葡萄的健康生长。各种微生物群落的动态演变和代谢作用是自然状态下葡萄转化成为葡萄酒的本质核心，主要是酵母菌利用糖类物质产生乙醇和其他代谢产物^[2]。因此，探究自然微生物群落在葡萄生态系统中的群落组成和动态演变对葡萄的生长和葡萄酒的酿造具有重要意义。

目前的葡萄栽培和葡萄酒酿造过程充斥着大量的化学助剂和过度的人为干预，其目的是保障葡萄的产量和发酵过程的可控性。特定的人类干预措施，包括杀虫剂、杀菌剂和除草剂的使用，影响了葡萄园生境的微生物多样性。例如，为了应对葡萄霜霉病，人们选择喷施大量的波尔多液，铜离子的富集不仅对环境和人体造成危害，而且造成霜霉病菌(Plamospara viticola)变异性和抗药性显著增强，从而驱使人们研制杀伤性更强的药物，但这些高毒性的农药没有选择性，不仅杀死了病原菌而且杀死了葡萄本身存在的有益微生物。已有研究发现，田间施药对自然发酵葡萄酒的酵母菌群落结构有显著影响，化学农药的使用会改变自然发酵过程酵母菌的种类和比例，导致酿酒酵母(Saccharomyces)等发酵有益菌的数量和比例降低，隐球酵母(Cryptococcus)等发酵有害菌的种类和数量提高^[3]。此外，由于地上部过度施加化学肥料和农药，使得葡萄所需养分主要通过外源充分供给，这不仅导致植株对养分的需求减少，葡萄树的根系逐渐变浅和退化，植株对逆境的抵抗力减弱，而且无选择性地杀死了地下部的葡萄园土壤微生物，尤其是能够影响植株环境抗性能力的根际微生物，造成了整个葡萄生态系统遭到破坏。在葡萄酒的酿造过程中，商业酵母、外源果胶酶和二氧化硫抗氧化剂的使用不仅增加了生产成本，而且同样也杀死了葡萄本身携带的有益微生物菌群，这些菌群伴随葡萄共同进化，具有明显的亲和性，能够增强葡萄酒的风味复杂性。这些外源化学成分的添加破坏了葡萄有益菌群的生长代谢，抑制了微生物代谢的酶系统，造成严重的葡萄酒风味同质化现象，使得葡萄酒丧失了自然风土特性。

鉴于此，我们首次提出了极简化的葡萄生态生产理念，其核心思想是尽量减少人为干预，增加葡萄生态系统的生物多样性，减少各种杀虫剂和化学肥料的使用，运用生物防治技术管理葡萄园的鸟害和虫害，倡导有机栽培模式，保持葡萄生态系统中微生物群落的自然状态，突出微生态的风土特征^[4]。同时，在葡萄酒发酵过程中，促进有益微生物的活动，抑制有害微生物活动，发酵过程也不使用化学方法，在不改变发酵培养基成分的前提下，尽量做到零添加，保证自然微生物在发酵过程中的代谢活动和相互作用。我们的目标是在自然状态下，通过物理手段促进微生物群落向葡萄和葡萄酒生态系统有益的方向发展，从而达到葡萄产业可持续、高质量发展的目的。所以，首先要了解自然环境下葡萄生态系统中微生物群落的物种组成和动态变化规律，及其在葡萄生长和葡萄酒酿造过程中的代谢作用，只有在这个基础上，才能充分认识微生物菌群的生态作用，找到实现目标的方法。

现代分子生物技术包括高通量测序技术的发展，弥补和更新了传统基于培养的方法对葡萄相关微生物的认识。多组学技术在葡萄生态学研究方面的应用能深入探讨微生物组与基因组和代谢组的联系，建立物种的基因通路和代谢产物以及表观调控的分子网络^[5]。本文对葡萄生态系统中自然微生物群落及其代谢酶系统的现有研究进行综述，包括葡萄园土壤、葡萄浆果表面和自然发酵过程中微生物的群落结构和动态变化，以及酵母代谢的酶系统，并阐述了特定物种与葡萄酒中代谢物的相关性和微生物间的相互作用，以期通过对微生物的群落结构和演变规律的全面认识，促进葡萄生态系统中微生物的生态作用和生理代谢研究，从而推动葡萄生态系统可持续、高质量发展。

1 葡萄园土壤微生物群落特征

葡萄园土壤是供给葡萄植株生理生长，促进果实发育的基础。土壤的理化性质如质地、pH、含水量、碳氮含量以及碳氮比等直接影响着土壤中微生物的数量和分布，而不同的农艺实践、葡萄园朝向和海拔等也能导致土壤微生物群落发生变化^[6]。土壤微生物与葡萄藤的关系可能是有益的、有害的或者二者共生，它们参与植物的营养吸收和植物对生物和非生物胁迫的抗性等关键功能，促进植株生长、增强抗病性和提高果实的产量^[7]。我们倡导的葡萄极简化栽培模式要求在葡萄园行内覆盖枝条，行间全面生草，从而改变葡萄园土壤微生物区系，形成特定的微气候模式。通过研究发现，以清耕为对照，行内覆盖枝条能够增加土壤中细菌、真菌和放线菌的数量和多样性^[8]，行间自然生草使得不同土层的微生物数量也有所提高，且深土层较表土层明显^[9]，同时生草还能避免冬季越冬的病原菌孢子在次年经雨水飞溅而重新侵袭葡萄藤树体。

研究表明，葡萄园土壤可能是葡萄生态系统中微生物的首要来源，参与植株地上部微生物群落的物种演变。土壤微生物可以经昆虫、风、降雨冲刷、浆果脱落等生物和非生物途径与植株地上部的微生物菌群进行相互传播，候鸟、蜜蜂和果蝇等动物媒介可以作为远距离的运输载体，从而跨地区传播酵母菌等微生物^[10]。土壤中根际微生物与植株本身关系较为紧密，根系可以释放大量的含碳化合物，称为根状沉积物，从而塑造根际微生物群落，驱动土壤对植物生长和防御的反馈。通常，根际微生物能进行活跃的物质转化和相互作用，使得根际微生物的种类低于非根际土壤^[11]。此外，葡萄根内生菌也能改变植株内生菌群的负载，影响地上部器官的物种组成，并在采收过程中附生迁移到葡萄表面，引起葡萄酒发酵过程中的菌群变化。

1.1 葡萄园土壤细菌的群落结构

微生物是土壤中的活跃组分，其中细菌数量约占70%−90%，其余是真菌和放线菌等^[12]。通常，葡萄园土壤中的细菌群落大多为变形菌门(Proteobacteria)、酸杆菌门(Acidobacteria)、拟杆菌门(Bacteroidetes)和放线菌门(Actinobacteria)。Burn等^[6]在纳帕谷葡萄园的细菌群落与土壤因素的相关性研究中发现，所有样本中4个最丰富的细菌群是变形菌门、放线菌门、酸杆菌门和拟杆菌门，且发现甲基杆菌属(Methylobacterium)、根瘤菌属(Rhizobium)、Skermanella和链霉菌属(Streptomyces)与经度、纬度、地形和降雨等因素均呈正相关，无色杆菌属(Achromobacter)、贪噬菌属(Variovorax)、欧文氏菌属(Erwinia)、假单胞菌属(Pseudomonas)和节细菌属(Arthrobacter)均与环境因素呈负相关，表明葡萄产区、气候和地形通过影响土壤特性而改变土壤细菌群落组成。Zarraonaindi等^[13]发现葡萄植株地上部的细菌多样性低于地下部，根际的核心细菌群落包括黄单胞菌目(Xanthomonadales)、根瘤菌目(Rhizobiales)、慢生根瘤菌属(Bradyrhizobium)、腐螺旋菌目(Saprospirales)、噬纤维菌目(Cytophagales)和放线菌目(Actinomycetales)，土壤可能是葡萄生态系统细菌群落的源库，一些促进葡萄生长的菌群和根系菌群能够在植株富集，且土壤细菌群落受土壤pH和碳氮比的显著影响。同样，Ma等^[14]使用高通量测序技术分析了新疆葡萄园的微生物多样性，他发现土壤中细菌的相对丰度高于叶片和果实，土壤中最丰富的细菌属是节细菌属，其次是Kaistobacter和Skermanella，不同地理位置的独特气候导致了微生物群落的多样性，而果实和叶片上的微生物群落很容易受到葡萄园土壤的影响。王晓雯等^[15]也对葡萄园土壤的细菌群落结构多样性进行了分析，实验表明根际土壤细菌多样性和丰度均低于非根际土壤，土壤中的优势细菌属包括乳球菌属(Lactococcus)、节细菌属、Candidatus Nitrososphaera、亚硝化螺菌属(Nitrososphaera)、热单胞菌属(Thermomonas)等，其中根际土壤中节细菌属、泛菌属(Pantoea)、芽孢杆菌属(Bacillus)、鞘脂单胞菌属(Sphingomonas)的丰度明显低于非根际土壤，冗余分析表明，土壤细菌群落多样性与土壤pH值、有机质、有效磷、淀粉酶和蔗糖酶含量具有不同程度的相关关系。

1.2 葡萄园土壤真菌的群落结构

与细菌群落相比，葡萄园土壤中真菌群落的数量和多样性较低，但Liu等^[16]发现土壤真菌群落与葡萄醪的真菌群落具有较高的相关性，认为土壤真菌群落是葡萄园生态系统的重要组分，对葡萄酒的地区风土特性影响更大。她通过随机森林模型分析发现土壤特性和天气因素强烈影响土壤真菌的多样性，降水和碳氮比是土壤真菌丰富度和群落组成的最佳预测因子，并且土壤真菌较细菌对环境条件更为敏感，它们能提高植株对当地环境的适应性，增强葡萄和葡萄酒的区域特征表达。Wei等^[17]发现新疆产区3个葡萄园土壤的优势真菌群包括Ascomycota、Sordariales、Tetracladium和Geomyces等，还含有少量的Erysiphe、Pleosporales、Penicillium和Scleroderma等菌群，相关菌属数量受到季节变化的影响。Ramírez等^[18]从2个相邻葡萄园的果实和土壤中分离可培养微生物，随后用其接种葡萄酒发酵，发现土壤中发酵型酵母菌的数量在接近采收时显著增加，Aureobasidium、Cryptococcus、Filobasidium、Pichia、Rhodosporidium和Torulaspora仅存在于土壤中，Saccharomyces和Lanchacea存在于采收后的土壤和葡萄酒中，葡萄园土壤是葡萄发酵酵母菌的天然来源，如果葡萄园土壤中的灰尘过多地积聚在葡萄串上，或者在收获期葡萄醪受到土壤的直接污染，土壤中Torulaspora和Lanchacea的杀手菌株可能导致发酵问题，深入研究葡萄园中的真菌生态学将了解葡萄植株如何在每年的生长周期中与土壤真菌相互作用，从而影响地上部的真菌群落组成。

2 葡萄表面微生物的群落特征

葡萄浆果表面附着有各种微生物，如细菌、酵母菌和丝状真菌，健康葡萄表面微生物的数量大致为10⁷−10⁸ CFU/g^[19]，这些微生物群可能受到土壤和人类学条件的影响，而且果实富集的微生物在发酵过程中会持续存在，影响葡萄酒的发酵质量。通常，葡萄表面微生物群落结构组成受到地理因素、气候、紫外线照射、栽培模式、年份、葡萄品种、成熟期、以及病虫害和农药、杀菌剂等因素的影响^[20]。在特定的葡萄和葡萄酒产区，微生物菌群每年繁殖生长，已经适应了当地的地理条件、气候和品种特性，且伴随自然选择的作用形成了该产区甚至是该品种特有的微生物群落^[21]。葡萄表面微生物的数量与浆果含糖量的变化和果实渗出营养成分的改变直接相关，葡萄破损和腐烂会显著影响浆果表面微生物的相互作用，改变微生物群落的生境状态。浆果表面常见的自然微生物及其生理作用见表 1。

2.1 葡萄表面酵母菌多样性

葡萄果实表面的酵母菌生物多样性可以受到葡萄品种、果实质量、地理环境、生长期等因素的影响^[22]。未成熟的葡萄果实表面酵母菌的数量很低，约为10¹−10³ CFU/g，在葡萄采收时增加到10³−10⁶ CFU/g，且主要是非酿酒酵母，未成熟时浆果表面酿酒酵母(S. cerevisiae)的数量很少，葡萄破损可以显著增加酿酒酵母的种群数量^[23]。

浆果表面的酵母菌分属担子菌类和子囊菌类，担子菌酵母在转色期之后数量明显增多，例如：隐球酵母属(Cryptococcus)、红酵母属(Rhodotorula)和Filobasidium等^[24]。它们可以在营养较低的环境下生长，在葡萄园中分布广泛，但它们在葡萄酒的环境下不能生存，不能发酵糖分。子囊菌类的Aureobasidium pullulans (黑酵母菌)是一种类酵母真菌，广泛存在于浆果表面，也不能参与葡萄酒发酵。A. pullulans在葡萄坐果时分布广泛，转色期时数量显著下降，逐渐被发酵型酵母所取代，在采收期时数量最少^[25]。当葡萄成熟期时，随着浆果表面积膨大，糖分和营养物质的可利用性增加，子囊菌类的弱发酵型酵母逐渐增多，主要包括有孢汉逊酵母属(Hanseniaspora)、假丝酵母属(Candida)、梅奇酵母属(Metschnikowia)、毕赤酵母属(Pichia)、德巴利氏酵母属(Debaryomyces)和克鲁维酵母属(Kluyveromyces)等，其中有孢汉逊酵母属和梅奇酵母属多为优势菌属^[26-27]。葡萄腐烂和破损会导致葡萄汁流出，易形成高糖环境，使得葡萄表面的一些强发酵型酵母属和有害酵母属数量增加，例如有孢圆酵母属(Torulaspora)、接合酵母属(Zygosaccharomyces)、类酵母属(Saccharomycodes)、裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)和酒香酵母属(Brettanomyces)等，这些酵母的代谢活动大多会引起葡萄酒的产膜败坏，多数被视为葡萄酒发酵的有害微生物^[28]。

Martins等^[29]研究了不同栽培模式下葡萄成熟阶段果实表面的真菌变化，发现产自有机栽培的果实表面微生物数量明显高于常规葡萄园，并且过熟期时葡萄表面真菌数量最多。Kántor等^[30]测定了14个葡萄品种的表皮微生物，发现Hanseniaspora uvarum、Metschnikowia pulcherrima和Rhodotorula在多数葡萄品种表面较为常见，少量的A. pullulans、Kluyveromyces marxianus和Candida saitoana等物种为少数品种所特有。Combina等^[31]分离鉴别了门多萨产区马尔贝克葡萄表面的酵母菌群落，得到Kloeckera apiculata、M. pulcherrima、Pichia membranifaciens、Saccharomycodes ludwigii、Candida sp.、Issatchenkia orientalis和Rhodotorula spp.等物种，采收期前后的降雨对酵母菌群的数量和质量均有影响。Cordero-Bueso等^[32]也发现有机和常规葡萄园中西拉、歌海娜和巴贝拉葡萄的酵母菌群明显不同，S. cerevisiae、C. stellata、H. guilliermondii和M. pulcherrima在有机葡萄表面数量较多，在常规的葡萄表面较少，说明栽培模式能影响葡萄酵母菌群落的组成。Jara等^[33]对智利6个产区的葡萄果实表面酵母菌进行鉴定，发现主要的非酿酒酵母有Metschnikowia、Hanseniaspora、Rhodotorula，还包括少数Cryptococcus、Hyphopichia、Candida和Aureobasidium，不同菌群的分布与当地的纬度、降雨量、相对湿度和温度均相关。

2.2 葡萄表面霉菌多样性

葡萄浆果表面附着有寄生霉菌和腐生霉菌两大类，寄生霉菌能够引起葡萄病害，这些病原菌会对葡萄生长产生负面影响，导致葡萄枯萎、皱缩、藤蔓腐烂和组织损伤。例如Plamospara viticola能够引起葡萄霜霉病，Erysiphe necator能导致葡萄白粉病，尤其是高湿多雨的天气有利于分生孢子的产生和传播，易引起病害的发生。腐生霉菌包括Cladosporium spp.、Aspergillus spp.、Penicillium spp.等，它们能分泌真菌毒素并引起葡萄腐烂^[34]，其中灰葡萄孢(Botrytis cinerea)侵染会引起葡萄灰霉病，Greeneria uvicola造成葡萄苦腐病，Aspergillus能够分泌赭曲霉毒素A，干扰微生物的生态环境，影响酒精发酵中酵母的生长代谢。Kioroglou等^[35]研究了澳大利亚产区的赤霞珠和设拉子在2个成熟阶段的真菌群落组成，发现Aureobasidium和Mycosphaerella是葡萄表面普遍存在的真菌属，Penicillium、Colletotrichum、Aspergillus和Botrytis在葡萄表面的数量也较多，其比例取决于地区、品种和成熟期，在成熟采收阶段，Penicillium对赤霞珠样品影响最大，而Botrytis对设拉子样品影响最大。浆果表面的霉菌也只能在葡萄表面生长，不能在葡萄酒环境下存活，然而它们可以引起葡萄破损，分泌代谢物而间接影响发酵菌群的存活状态。

2.3 葡萄表面细菌多样性

葡萄表面的细菌主要包括环境型细菌、乳酸菌和醋酸菌等三大类。葡萄成熟过程中，葡萄表面细菌数量逐渐增加，在浆果过熟期时达到最高水平。环境型细菌主要指存在于自然环境中的细菌，它们只存在葡萄表面，也不能在葡萄酒环境中存活，属于无害的污染物，主要包括假单胞菌属(Pseudomonas)、沙雷氏菌属(Serratia)、肠球菌属(Enterococcus)、芽孢杆菌属(Bacillus)、微球菌属(Micrococcus)和葡萄球菌属(Staphylococcus)等^[36]。Martins等^[37]研究了不同成熟过程和栽培模式下梅洛葡萄表面附生细菌的动态和多样性，结果表明，葡萄生长过程中，果实表面革兰氏阴性菌群(主要是假单胞菌)逐渐减少，而革兰氏阳性菌群(主要是微球菌)逐渐增加，有机和常规栽培的葡萄表面均以假单胞菌属和微球菌属为主，还发现少量短小杆菌属(Curtobacterium)、葡萄球菌属(Staphylococcus)、肠杆菌属、芽孢杆菌属和节细菌属。此外，杀菌剂中铜离子浓度和细胞密度之间呈负相关，说明铜离子浓度可以抑制细菌群落。Mezzasalma等^[38]对意大利北部和阿尔卑斯山地区以及西班牙北部的赤霞珠、霞多丽和长相思微生物群的研究中发现，尽管产地和品种不同，但果实表面的细菌群落均含有芽孢杆菌属、甲基杆菌属、鞘脂单胞菌属，多数细菌属在葡萄园土壤和果实表面同时存在，也表明葡萄园土壤可能是葡萄相关细菌的主要来源，且机器学习分析发现可以通过葡萄的微生物组成高精度地预测葡萄的品种和地理来源。

相比于环境型细菌，乳酸菌和醋酸菌可以在葡萄酒的环境下生存并显著影响葡萄酒的质量。健康的葡萄表面乳酸菌和醋酸菌的群落数量一般都在10²−10³ CFU/g之间，乳酸菌主要包括酒球菌属(Oenoccocus sp.)、乳杆菌属(Lactobacillus spp.)、片球菌属(Pediococcus spp.)和明串珠菌属(Leuconostoc spp.)等，酒酒球菌(Oenoccocus oeni)是启动苹果酸乳酸发酵的主要菌种，但其在葡萄表面数量较少^[39]。醋酸菌是指能够生成醋酸的一类细菌的统称，主要包括葡糖杆菌属(Gluconobacter spp.)、醋酸杆菌属(Acetobacter spp.)和葡糖醋杆菌属(Gluconoacetobacter spp.)，葡萄破损和霉菌侵染会显著增加醋酸菌的丰富度和多样性，数量可能达到10⁶ CFU/g。醋酸杆菌属主要存在于酸腐葡萄中，而Gluconobacter和Gluconoacetobacter主要存在于健康的浆果表面。Nisiotou等^[40]研究了健康葡萄和被Botrytis侵染的葡萄表面细菌的组成，发现被Botrytis侵染的葡萄表面乳酸菌株和醋酸菌株的数量明显增加，Botrytis侵染可能改变了细菌生境。

3 葡萄酒自然发酵中微生物的群落特征

葡萄酒的自然发酵是一个由不同微生物种属之间相互协作的复杂过程，其中酵母菌、乳酸菌和醋酸菌对葡萄酒的质量有主要影响。自然发酵也受多种因素的影响，包括内源的微生物区系、葡萄品种、气候条件、酿酒过程等^[41]。因此，自然发酵的质量很难控制，多种微生物的相互作用和代谢过程容易引起葡萄酒的发酵停滞和形成不良风味，且年份差异较大，可能每年的葡萄酒质量风格都不同^[42]。微生物多样性在发酵过程中不断变化，群落之间竞争生态位以及菌群对环境变化的耐受性不同，使得优势菌群才能在葡萄醪的生境中存活^[43]。

3.1 自然发酵过程中酵母菌群落的动态变化

在葡萄酒的自然发酵过程中，由于不同菌种和菌株的相互作用，以及对营养物质的竞争和对乙醇的耐受力不同，使得一些酵母菌的生长逐渐受到抑制，形成不同的发酵动力曲线^[44]。很多研究表明，酒精发酵主要由非酿酒酵母启动，通常是Hanseniaspora、Candida和Metschinkowia等属的酵母菌，它们多需氧且乙醇耐受性较低，而Saccharomyces在发酵前期数量较少。发酵启动后，非酿酒酵母的数量可能逐渐增加，有时浓度可达到10⁶−10⁷ CFU/mL，可能出现Pichia和Issatchenkia等属的酵母。在发酵中后期，由于S. cerevisiae对乙醇的抗性和发酵能力均较强，因而数量逐渐增加，浓度可达到10⁷−10⁸ CFU/mL，而大多数非酿酒酵母对发酵环境变化的抗性较低，生长活性受到抑制，但在发酵末期也能检测到少量抗性较强的非酿酒酵母，在发酵后期，酿酒酵母(S. cerevisiae)的种群数量占据绝对优势，主导酒精发酵的完成^[45]，表 2总结了葡萄酒发酵相关酵母菌的酿酒学特性。

Padilla等^[55]对Priorat地区的歌海娜和佳利酿葡萄进行自然发酵，发现歌海娜和佳利酿葡萄酒发酵前期存在的酵母菌主要是A. pullulans、H. uvarum、C. zemplinina、I. terricola和S. cerevisiae，其中A. pullulans和H. uvarum的数量较多，S. cerevisiae数量很少，发酵中期H. uvarum数量减少，S. cerevisiae的数量相对增加，发酵结束时S. cerevisiae数量最多，还存在少量的C. zemplinina。Díaz等^[56]对不同品种自然发酵酵母群落的动态变化研究发现，由于氮源的减少和酒精含量的增加，发酵过程中酵母菌的物种组成逐渐减少，不同品种发酵结束时发酵醪中的酵母菌种的组成不同，但主要包括Saccharomyces bayanus、S. cerevisiae、M. pulcherrima、Pichia klyveri、P. membranifaciens和Rhodotorula mucilaginosa等菌种。

3.2 自然发酵过程中细菌群落的动态变化

发酵过程中细菌群落的丰度和多样性会增加其与酵母菌的拮抗作用，抑制酒精发酵的进程。葡萄酒发酵环境中存在的细菌主要包括乳酸菌、醋酸菌和芽孢杆菌等。在纳帕产区赤霞珠和霞多丽的发酵过程也发现了欧文氏菌属(Erwinia)、肠杆菌科(Enterobacteriaceae)和假单胞菌属(Pseudomonas)等^[57]，发现肠杆菌科与葡萄酒的发酵速率存在负相互作用，假单胞菌与葡萄酒的发酵速率存在正相互作用，葡萄附生细菌在葡萄酒发酵中的性质和作用的研究尚不明确。

葡萄酒中的乳酸菌主要包括乳杆菌属(Latobacillus)、片球菌属(Pediococcus)、明串珠菌属(Leuconostoc)和酒球菌属(Oenococcus)，乳酸菌在发酵前期数量较少，通常少于10³ CFU/mL，发酵后期数量逐渐增加，可达到10⁶−10⁸ CFU/mL，而且乳酸菌的生存依赖于发酵液中的pH值，pH值高于3.5有利于片球菌属和乳杆菌属的存活，这时有些乳酸菌(包括短乳杆菌、植物乳杆菌和有害片球菌等)能够分解酒石酸，引起葡萄酒的败坏。pH低于3.5有利于酒球菌属的存活。酒酒球菌(O. oeni)能够耐受较低的pH和较高的二氧化硫和乙醇浓度，其含量在发酵后期逐渐增加，从而启动苹果酸乳酸发酵^[58]。通过苹果酸乳酸发酵能够代谢苹果酸产生乳酸和CO₂，消耗细菌繁殖的营养物质，产生细菌素，从而抑制不良细菌生长，提高葡萄酒的生物学稳定性^[59]。

葡萄酒中的醋酸菌主要包括醋酸杆菌属(Acetobacter)、葡糖杆菌属(Gluconobacter)和葡糖醋杆菌属(Gluconacetobacter)。在有机发酵的葡萄酒中，葡糖杆菌属的数量较多。如果葡萄酒发酵过程控制不当，大量的氧气进入能显著增加醋酸菌的数量，导致葡萄酒挥发酸含量增高，引起酒的酸败。醋酸菌和乳酸菌的存在会与酵母菌竞争营养，抑制酵母发酵速率。Portillo等^[60]研究歌海娜葡萄自然发酵过程中细菌和酵母的生长动力学，发现醋酸杆菌科(Acetobacteraceae)占据细菌的主要部分，其中葡糖杆菌属(Gluconobacter)数量较高，在发酵中期达到最大值，而醋酸杆菌属(Acetobacter)的数量较为稳定，葡糖醋杆菌属(Gluconacetobacter)数量呈下降趋势，在发酵末期数量最低。Mezzasalma等^[61]使用高通量测序鉴定了歌海娜葡萄和自然发酵葡萄醪中的细菌和真菌群落，发现Gluconobacter和Gluconacetobacter在发酵前期广泛存在，发酵末期数量较低，乳杆菌属(Lactobacillus)种群数量在发酵前期数量较少，发酵后期数量较高，从而能在酒精发酵后迅速启动苹果酸乳酸发酵。

4 葡萄酒发酵过程中酵母代谢的酶系统

传统的葡萄酒发酵过程中，为了控制葡萄酒的发酵进程，提高葡萄酒的澄清度、抑制杂菌滋生和防止氧化，往往选择人为添加优选的商业酵母、外源果胶酶和二氧化硫。葡萄醪中的微生物系统和酶系统决定了发酵过程的生化反应，但这些外源成分的添加不仅降低了发酵醪中自然微生物的多样性，而且抑制了微生物本身代谢的酶系统。其中，酵母菌在发酵过程中会产生丰富的胞外酶，这些酶可以促进芳香前体物质的释放和葡萄醪的澄清，对葡萄酒中代谢物的特征有重要影响^[62-63]，自然发酵的酵母菌群能够增加葡萄酒中挥发性化合物的含量，赋予葡萄酒特殊的香气轮廓。

4.1 酵母代谢与香气相关的酶类

酵母菌分泌的糖苷酶和碳-硫裂解酶可以水解结合态的品种香气，促进游离态芳香物质的释放。葡萄酒中的品种香气是主要存在于葡萄外果皮的甲氧基吡嗪、C₁₃-降异戊二烯类化合物、挥发性硫化合物和萜烯等，它们以游离态或结合态的形式存在，结合态的芳香物质只有转化为游离态才具有香气特性^[64]。其中，萜烯类物质主要以葡萄糖苷形式存在，经酵母菌代谢的酶水解可以释放香茅醇、香叶醇、芳樟醇和橙花醇等萜烯醇。单糖苷单萜类化合物只需要经β-D-葡萄糖苷酶水解，即可释放葡萄糖和萜烯，而双糖苷单帖类的水解需要两步进行。首先，根据缀合物不同，特定的α-L-阿拉伯糖苷酶、α-L-鼠李糖苷酶或β-D-洋芹糖苷酶可裂解特定的五碳糖与葡萄糖之间的化学键，释放β-D-葡萄糖单糖苷。然后，释放的单糖苷被一个β-D-葡萄糖苷酶水解，释放葡萄糖和相应的单萜^[65]。结合态挥发性硫醇是以半胱氨酸-3-巯基-1-醇(Cys-3MH)和半胱氨酸-4-巯基-4-甲基戊烷-2-酮(Cys-4MMP)的半胱氨酸酰化形式存在，通过酵母代谢产生的碳-硫裂解酶水解半胱氨酸或谷胱甘肽前体释放游离态的挥发性硫醇^[66]。S. cerevisiae可以产生糖苷酶和碳-硫裂解酶，多数非酿酒酵母可以分泌糖苷酶，例如Candida、Hanseniaspora、Kluyveromyces、Metschnikowia、Debaryomyces等，少数非酿酒酵母可以释放碳-硫裂解酶，包括：C. zemplinina、M. pulcherrima、P. kluyvery、T. delbrueckii等。

4.2 酵母代谢的其他酶类

酵母菌还可以释放淀粉酶、纤维素酶、果胶酶等成分，一些产酶酵母还能分泌蛋白酶、酯酶、木聚糖酶和脲酶等胞外酶。H. uvarum的菌株能产生淀粉酶、纤维素酶，H. anomala、T. delbrueckii、C. zemplinina可以产生果胶酶和淀粉酶，S. cerevisiae可以分泌果胶酶和纤维素酶等。果胶酶可以增加出汁率，提高葡萄酒的澄清和过滤能力，释放葡萄皮中的色素和风味物质，对葡萄酒的感官特性产生积极影响^[67]。α-淀粉酶有利于葡萄中不溶性淀粉的水解和利用；蛋白酶能增加葡萄酒的澄清率；酯酶是重要的发酵香气成分。这些酶作用于葡萄汁中相关底物能改变葡萄酒中的生化反应^[68]。Merín等^[67]利用本土优选的高产果胶酶的A. pullulans与S. cerevisiae混合发酵，发现在冷浸渍过程中，混合发酵较接种纯培养S. cerevisiae能显著提高果胶分解活性，而不影响发酵进程，明显改善葡萄酒的颜色特征、芳香性酯类和萜类物质的含量，这可能是由于浸渍过程中酵母代谢较高的果胶酶活性促进浆果中的水溶性化合物的提取，如花青素和芳香前体物质等。微生物自身的酶系统代谢机理的研究，对于探究葡萄酒发酵中的自然能量体系和微生物代谢作用与葡萄酒风味物质的联系具有重要意义，利用产酶的有益微生物不仅能够降低生产成本，而且可以突出微生物的风土特性。

5 微生物生态作用对葡萄酒代谢组分的影响 5.1 自然微生物与葡萄酒中代谢物的相关性

葡萄酒中的代谢物多是由微生物产生、消耗或修饰的，基于各种预测关联模型的分析，发现发酵微生物和代谢物之间具有一定的相关性，特定物种能够在自然发酵中产生明确的代谢特征。Lu等^[69]基于Spearman相关性指数发现马瑟兰葡萄发酵不同时期的某些微生物与挥发性化合物的形成密切相关。因此，葡萄汁中微生物的物种组成可以作为发酵开始前葡萄酒中代谢产物预测的生物标志。Bokulich等^[57]测定了美国纳帕谷不同的AVA产区和不同葡萄园的赤霞珠和霞多丽葡萄酒中微生物多样性和代谢组分的关系，发现葡萄汁中的微生物和代谢物都能对葡萄产区进行不同程度的区分，某些微生物和代谢产物具有显著的相关性。实验显示，赤霞珠的细菌群落与假定代谢物谱的关联较密切，而霞多丽的真菌群落与假定的代谢物谱的关联更为密切，原因可能是赤霞珠红葡萄酒经过了苹果酸乳酸发酵的细菌代谢过程。随机森林模型也显示葡萄醪的微生物组成可以预测葡萄酒中的代谢物成分。例如，Cladosporium和Bacillaceae能够预测比对到C₆酮酸，P. guilliermondii能够预测到C₆H₁₀O₂酸、酯或内酯，Saccharomyces、W. anomalus、Acetobacteraceae和一些附生菌Botryotinia fuckeliana、Enterobacteriaceae、Pseudomonas都是最具预测性的微生物，图 1为实验中微生物对代谢物丰度的预测分析结果，这些结果显示了许多在葡萄酒发酵过程中发挥未知作用的微生物群与葡萄酒化学之间的关联性。然而，发酵微生物与葡萄酒代谢物的相关研究仍然较少，了解自然微生物群落的代谢功能及其代谢路径以及它们与葡萄植株的相互作用仍然是很重要的。

5.2 自然微生物间的相互作用

为保证自然发酵的质量，需要尽可能利用有益的微生物，产生优良的代谢产物，同时抑制病原体和腐败微生物的活动。这需要了解微生物菌种之间的相互作用。从现象上看，2个微生物种群之间的相互作用可能是积极的，也可能是消极的，意味着生长促进或抑制。微生物对代谢产物的相互利用，即其中一个群体受益于另一个群体的代谢副产物就是一种积极的相互作用，这可以降低种群间争夺资源的程度。微生物间的负相互作用可能是对资源的竞争(包括电子供体和受体、营养物、光或物理空间)，也可能是直接的细胞间接触，或者产生毒素和分泌抑制化合物等^[70]。例如，A. pullulans具有控制果实腐败微生物(Aspergillus rots)的潜力，Epicoccum nigrum能够有效的拮抗B. cinerea和P. viticola病原体。Kasfi等^[71]对果实中Aspergillus flavus、A. niger和A. ochraceus分泌的黄曲霉毒素和赭曲霉毒素A的积累进行拮抗试验，筛选出了5株酵母和2株细菌，它们表现出明显的抗真菌活性，其拮抗微生物的作用具有替代杀菌剂使用的潜力。

自然发酵过程中非酿酒酵母与酿酒酵母的相互作用与葡萄醪的初始糖、酸浓度、可同化氮浓度、发酵温度和氧浓度有关^[22]。最近的研究表明，一些酿酒酵母可以在稳定生长期发生细胞间接触，产生抑菌肽抑制其他非酿酒酵母菌株^[72]。有些霉菌分泌的真菌毒素也能抑制发酵过程中酵母菌的生长，例如某些代谢产物如短至中链脂肪酸(如乙酸、己酸、辛酸和癸酸)和酵母杀手毒素可以促进酵母细胞死亡^[73]。同时，还有研究发现自然微生物细胞间存在群体感应现象，即微生物细胞间接触达到一定的密度时可以触发群体感应，通过分泌特定的群体感应分子抑制细胞的生长。例如，当C. albicans培养达到细胞高密度时，法尼醇在培养基中积累会抑制酵母细胞向丝状生长过渡，在S. cerevisiae、H. uvarum、Torulaspora pretoriensis、zygosomyces bailii、C. zemplinina和Dekkera bruxellensis的研究中也发现了2-苯乙醇、色氨酸和酪氨酸等群体感应分子在细胞达到高密度时在培养基中释放，产生原因可能与酵母的氮代谢有关^[74]，关于不同微生物之间可能的防御机制和相互作用机理也需深入研究。

6 展望

目前的葡萄酒产业面临着大量化学药剂使用和过度人为干预的现状。在葡萄栽培方面，化肥和农药的使用严重破坏了葡萄生态系统，抑制了自然微生物的多样性。葡萄酒酿造过程中商业酵母、酶制剂和二氧化硫的添加，也引起葡萄酒的同质化现象并增加了生产成本。为此，保证葡萄产业的可持续发展才能从根本上保障获得优质的葡萄原料和提高葡萄酒的质量。我们结合多年对葡萄生态系统的研究，创造性地提出了极简化生态模式，其理念是尽量减少过度的人为干预，保障葡萄的最佳状态，发挥葡萄生态系统的生态作用，提高葡萄自身对环境的抵抗力。本综述对微生物的群落组成和动态变化及酶系统进行了概述，发现葡萄生态系统中微生物群落的研究大多深入到表型层面，关于微生物间互作机理和微生物与环境和代谢组分的相关性研究仍不清晰，为此提出了以下一系列重要的研究方向，以推动自然微生物内在机理和生态作用的研究发展。

6.1 基于多组学的方法，探索微生物与环境和植株的相互作用

随着多组学技术(例如宏基因组、宏转录组、宏蛋白组和宏代谢组等)的发展，使得实验提取、测序的成本大大降低，建立多组学和方法学统计分析(例如CCA和RDA分析等)的关联能够深入探究微生物群落与环境(非生物因素)和宿主(根际、叶际、果实表面等生物因素)的相互作用，从而深入到分子基因层面全面认识微生物群落的生态功能，并将信息整合到数据模型以提高微生物群落对葡萄生态系统功能的预测性。

6.2 确定特定产区的标志性物种或指示物种及其代谢作用，建立微生物与葡萄酒中标志代谢物的相关性

这需要尽可能多的在不同产区采集葡萄样本以丰富数据库，由于自然微生物群落具有时间动态性，随着物候期的变化，微生物群落组成不断更替，需要了解特定地区的微生物群落变化模式。通过宏基因组学和信息代谢组学分析葡萄酒中可能存在的代谢途径，利用LEfSe检验方法确定生物标志物，找到有效区分、判断不同生长阶段和发酵时期的指示物种，可为后续菌群差异响应和互作机理研究提供指导。

6.3 确定微生物代谢物对葡萄酒感官质量和人体健康的影响

食品安全问题关系到人们的生命健康，由于自然发酵的葡萄酒是不可控的，多种微生物复杂的生化反应可能产生有害的代谢物，例如生物胺和氨基甲酸乙酯具有致癌性，因此需要在营养层面加深研究并应用动物学实验确定其对人体健康的影响。因此，应对自然发酵的葡萄酒进行成分检测，同时感官研究也很有必要来确定微生物与代谢物的关联是否延伸到人们可以察觉葡萄酒的地区风土差异，这对减少葡萄酒的同质化现象具有重要意义。

6.4 研发微生物组群设计与调控技术，利用有益微生物，抑制有害微生物^[75]

应用合成生物学方法和微生物工程学技术，培养利用葡萄生态系统中的有益菌群，抑制有害的微生物，从而增强葡萄的抗逆性并保持植株健康，通过有益菌群产生优良的代谢产物改善葡萄酒的风味，提高葡萄酒的风土特征，促进自然微生物群落向葡萄生态系统有益的方向发展。