2021, Vol. 48扩展功能
文章信息
- 戴爽, 李荷
- DAI Shuang, LI He
- β-葡萄糖苷酶Bgl747的定向筛选、重组表达与酶学性质
- Targeted screening, recombinant expression and enzymatic properties of β-glucosidase Bgl747
- 微生物学通报, 2021, 48(8): 2524-2533
- Microbiology China, 2021, 48(8): 2524-2533
- DOI: 10.13344/j.microbiol.china.201097
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文章历史
- 收稿日期: 2020-11-23
- 接受日期: 2021-03-11
- 网络首发日期: 2021-04-19
β-葡萄糖苷酶(EC3.2.1.21)是一种糖苷水解酶，能够水解芳香基或羟基与糖苷键间的β-1, 4-糖苷键，从而生成葡萄糖[1]。β-葡萄糖苷酶目前已被用于化学工业[2]、食品[3]、医药[4]等各个领域。在纤维素水解过程中，纤维二糖被β-葡萄糖苷酶水解成葡萄糖分子，形成有机肥料，可供植物吸收，因此加速纤维素降解的关键酶是β-葡萄糖苷酶。目前，大多数β-葡萄糖苷酶都来自植物和真菌，而且来源于细菌的β-葡萄糖苷酶存在反应条件适用范围窄、酶活力普遍较低、热稳定性差等问题。因此筛选获得催化效率高、酶学性质优异的β-葡萄糖苷酶具有重要的现实意义。
秸秆还田是指将秸秆直接施入田地里，利用秸秆作为作物生长的养分。这些肥料不仅可以增加土壤有机质，还能改善土壤的结构。秸秆还田土壤中存在大量的微生物[5-6]，功能丰富、增殖速度快、适应能力强是它们的特点，因而利用微生物降解秸秆具有广阔的应用前景[7]。农作物秸秆的纤维结构较为复杂，其降解过程需要多种纤维素酶共同完成，而促进纤维素降解的关键酶是β-葡萄糖苷酶，因此其他纤维素酶与从秸秆还田土壤中筛选的β-葡萄糖苷酶构成了秸秆降解菌，这大大解决了焚烧秸秆所造成的环境污染等问题。
利用功能筛选法从黑龙江省牡丹江市郊区玉米秸秆还田土壤中获得了一株β-葡萄糖苷酶，经载体构建并在大肠杆菌中表达，通过诱导及表达条件优化获得纯度较高的β-葡萄糖苷酶，对其酶学性质进行研究，以期为工业应用奠定基础。
1 材料与方法 1.1 菌株和质粒大肠杆菌Escherichia coli DH5α (克隆菌株)与E. coli BL21 (表达菌株)由本实验室-80 ℃保存，表达载体质粒pET-28a购自Novagen公司。
1.2 主要试剂和仪器质粒提取试剂盒(E.Z.N.A® Plasmid Mini Kit)、琼脂糖凝胶回收试剂盒(E.Z.N.A® Gel Extraction Kit)，Omega公司；His标签蛋白纯化试剂盒、Bradford蛋白浓度测定试剂盒，上海碧云天生物技术有限公司；限制性内切酶Hind Ⅲ、EcoR I、定量DNA marker，TaKaRa公司；T4 DNA连接酶，Fermentas公司；氨苄青霉素(Amp)、异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)，Sigma公司；p-nitrophenyl- β-D-galactopyranoside (pNPG)、七叶苷、柠檬酸铁铵，生工生物工程(上海)股份有限公司；酵母提取粉(Yeast Extract)、胰蛋白胨(Tryptone)，Oxoid公司。
基因测序及PCR引物合成由广州艾基生物技术有限公司完成。
PCR扩增仪，BA公司；超声波细胞破碎仪，宁波新芝生物科技股份有限公司；酶标仪，Bio-Tek公司。
1.3 定向筛选称取10 g土壤样品，放入250 mL锥形瓶中，加入90 mL无菌水，28 ℃、180 r/min摇床上充分振荡20 min，使样品中微生物充分分散于水中。取出经振荡浑浊的菌液，静置10 min，吸取100 μL上清液加入盛有900 μl无菌水的1.5 mL EP管中吹打混匀，得到10-2稀释菌液，照此方法依次制备浓度梯度稀释液(10-3、10-4、10-5、10-6、10-7、10-8)。取7个浓度梯度的稀释菌液80 μL涂布于LB固体培养基上，于37 ℃恒温箱中倒置培养24 h，将长出的菌落再次涂布于固体培养基，于37 ℃恒温箱中倒置培养24 h，挑取白色菌落点涂于β-葡萄糖苷酶筛选培养基(0.25%柠檬酸铁铵、0.1%七叶苷、100 μg/mL Amp)，于恒温培养基中培养12 h，观察有无黑色水解圈。
1.4 序列分析β-葡萄糖苷酶的蛋白质序列已保存在美国国立生物技术信息中心(NCBI)，登录号为MW197409。
使用在线翻译工具(http://web.expasy.org/translate/)预测蛋白分子量，使用网站ExPASy的在线程序ProtParam预测β-葡萄糖苷酶Bgl747的基本特性(http://www.expasy.org/tools/protparam.html)，利用SignalP 5.0 (http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)来预测其信号肽。
1.5 重组质粒构建与双酶切验证根据测序结果，设计一对引物Bgl747-F与Bgl747-R，具体引物序列如下：Bgl747-F：5′-CCGGAATTCCCCGTTGCGGTGTCATTATACTGAC-3′ (下划线为EcoR I酶切位点)；Bgl747-R：5′-CCGCTCGAGGCTCCCGAAGAACCTATGAAACCAATTG-3′ (下划线为Hind Ⅲ酶切位点)。采用Prime STARTM Max Premix进行PCR扩增，PCR反应体系：Bgl747模板1 µl，Bgl747-F (20 mmol/L) 1 µl，Bgl747-R (20 mmol/L) 1 µl，Prime STARTM Max Premix 14 µl，ddH2O 3 µl。PCR反应条件：94 ℃ 2 min；94 ℃ 20 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 50 s，共20个循环；72 ℃ 5 min；结束后于15 ℃保存。经纯化后将Hind Ⅲ和EcoR I酶切位点分别添加在序列两端，通过基因工程的方法将其与表达载体pET-28a相连接，获得pET-28a-Bgl747的重组质粒。重组质粒的双酶切验证体系：Hind Ⅲ 1 U，EcoR I 1 U，重组质粒1 µg，ddH2O 30 µl，10×H buffer 3 µl。在37 ℃下酶切，1 h后采用琼脂糖凝胶电泳的方法对样品进行验证。
1.6 重组蛋白的表达优化与纯化将含pET-28a-Bgl747的重组质粒转化至大肠杆菌BL21(DE3)中，于37 ℃、220 r/min的条件下培养至OD600在0.6-1.0范围内，添加IPTG诱导表达，至其终浓度分别为0.4、0.6、0.8 mmol/L，15、37和40 ℃于220 r/min培养10 h，分别取以上菌液4 ℃、8 000 r/min离心10 min收集沉淀，进行超声破碎(30 W，4 s/6 s，15 min)，进行SDS-PAGE凝胶电泳，根据蛋白条带确定最适的表达条件。最适表达条件下制样，超声破碎，经His标签蛋白纯化试剂盒纯化后进行SDS-PAGE分析。蛋白含量测定采用Bradford蛋白浓度测定试剂盒。
1.7 酶学性质分析 1.7.1 酶活测定取稀释10倍的酶液10 µl、pH为4.0的B-R缓冲液80 µl、50 mmol/L的pNPG 10 µl混合，45 ℃下反应20 min，加入200 µl NaCO3终止反应，吸取200 µl混合液，OD405平行测定3次，以不加酶的反应体系为对照组。酶活力单位(U)定义：每分钟分解pNPG产生1 µmol pNPG所需的酶量。
1.7.2 最适反应条件测定及稳定性分析在pH 4.0条件下，通过测定4、20-80 ℃温度范围内(间隔5 ℃)各个温度下的相对酶活确定最适反应温度；温度稳定性通过酶置于4、20-80 ℃温度(间隔5 ℃)下保温2 h后测定剩余活力，通过测定酶在B-R缓冲液(pH 1.0-11.0)中的相对酶活确定最适pH；pH稳定性：将酶置于不同pH条件下，45 ℃保存2 h后测定剩余酶活。
1.7.3 金属离子和化学试剂对酶活的影响最适温度和pH条件下，以不加金属离子和化学试剂的样品组作为对照，以反应体系中添加浓度分别为1 mmol/L和10 mmol/L的K+、Na+、Fe2+、Mg2+、Mn2+、Ca2+、Cu2+、Zn2+、Ni2+、Co2+、SDS、EDTA、咪唑、尿素和盐酸胍，以及添加浓度分别为1%、15%、30%的甲醇、乙醇、异丙醇、DMSO和Triton X-100为实验组，测定相对酶活，分析金属离子和化学试剂对酶活力的影响。
1.7.4 酶促动力学最适条件下，按照1.7.1所示的测定酶活力的方法，测定在不同浓度pNPG溶液下Bgl747的酶活力，绘制Linewear-Burk双倒数曲线，计算最大反应速率Vmax和米氏常数Km。
1.7.5 酶活力受不同浓度葡萄糖的影响最适条件下，在反应中加入0-4 mol/L浓度的葡萄糖溶液，室温放置2 h，测定各浓度下Bgl747的剩余酶活，以不含葡萄糖的酶液酶活力定义为100%。
1.8 数据处理方法所有试验数据均取3次重复的平均值，图表绘制采用Origin 9软件。
2 结果与分析 2.1 定向筛选用底物七叶苷功能筛选法，对β-葡萄糖苷酶进行初步筛选，发现筛选平板上有黑色水解圈(图 1)，证明其具有β-葡萄糖苷酶的活性，将其编号为B21-3。
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| 图 1 β-葡萄糖苷酶的筛选 Figure 1 Screening of β-glucosidase |
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经测序结果显示基因序列的插入片段中有一个β-葡萄糖苷酶编码基因的开放阅读框(Open Reading Frame，ORF)序列，该编码阅读框全长747 bp，编码248个氨基酸，预测其编码翻译的蛋白分子量大小为27.23 kD，将其命名为Bgl747。BLAST结果显示，Bgl747的氨基酸序列和糖苷水解酶GH1家族的β-葡萄糖苷酶有较高的序列一致性。多序列比对如图 2所示，Bgl747与所选相似性高的β-葡萄糖苷酶都拥有NEP这个GH1家族典型的保守序列。
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| 图 2 Bgl747和GH1家族其他成员的氨基酸保守序列比对 Figure 2 The conserved amino acid sequences alignment between Bgl747 and members of the GH1 family |
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经PCR扩增后出现了一条明显的DNA条带，结果如图 3显示，大小位于750 bp，与预期基因大小一致(6×His标签)。利用Hind Ⅲ和EcoR I对重组质粒pET-28a-Bgl747进行酶切验证，结果如图 4显示，重组质粒被酶切后出现了与预期大小一致的DNA片段，证明Bgl747已成功构建到表达载体pET-28a上。
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| 图 3 基因Bgl747的PCR扩增产物电泳图 Figure 3 Amplified products of gene Bgl747 electrophoresis 注：M：DL2000 DNA Marker；1、2：Bgl747基因 Note: M: DL2000 DNA marker; 1, 2: gene Bgl747 |
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| 图 4 重组质粒酶切验证电泳图 Figure 4 Electrophoresis identification of digested plasmids Note: M: DL2000 DNA Marker; 1: pET-28a-Bgl747; 2: pET-28a-Bgl747 digested by Hind Ⅲ and EcoR I |
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如图 5 SDS-PAGE分析结果所示，重组蛋白Bgl747在15 ℃几乎没有可溶性表达，37 ℃诱导时有较好的可溶性表达效果。由图 5可知，获得最佳蛋白表达的条件：OD600为1.0、37 ℃、0.6 mmol/L IPTG。经纯化后的蛋白浓度为1.82 mg/mL，如图 6所示，SDS-PAGE分析结果表明重组蛋白Bgl747的理论分子量(27.23 kD)和表观分子量(约28 kD)一致。
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| 图 5 Bgl747重组蛋白表达优化的SDS-PAGE分析 Figure 5 SDS-PAGE analysis of Bgl747 recombinant protein expression optimization 注：M：蛋白Marker；1：37 ℃、OD600=1.0、IPTG 0.0 mmol/L样品(未诱导)；2：37 ℃、OD600=0.6、IPTG 1.0 mmol/L诱导后沉淀样；3：37 ℃、OD600=0.8、IPTG 1.0 mmol/L诱导后沉淀样；4：37 ℃、OD600=1.0、IPTG 1.0 mmol/L诱导后沉淀样；5：37 ℃、OD600=1.0、IPTG 0.4 mmol/L诱导后沉淀样；6：37 ℃、OD600=1.0、IPTG 0.6 mmol/L诱导后沉淀样；7：37 ℃、OD600=1.0、IPTG 0.8 mmol/L诱导后沉淀样；8：15 ℃、OD600=1.0、IPTG 1.0 mmol/L诱导后沉淀样；9：37 ℃、OD600=1.0、IPTG 1.0 mmol/L诱导后沉淀样；10：40 ℃、OD600=1.0、IPTG 1.0 mmol/L诱导后沉淀样 Note: M: Protein Marker; 1: 37 ℃, OD600=1.0, IPTG 0.0 mmol/L sample (not induced); 2: 37 ℃, OD600=0.6, IPTG 1.0 mmol/L precipitation sample after induction; 3: 37 ℃, OD600=0.8, IPTG 1.0 mmol/L precipitation sample after induction; 4: 37 ℃, OD600=1.0, IPTG 1.0 mmol/L precipitation sample after induction; 5: 37 ℃, OD600=1.0, IPTG 0.4 mmol/L precipitation sample after induction; 6: 37 ℃, OD600=1.0, IPTG 0.6 mmol/L precipitation sample after induction; 7: 37 ℃, OD600=1.0, IPTG 0.8 mmol/L precipitation sample after induction; 8: 15 ℃, OD600=1.0, IPTG 1.0 mmol/L precipitation sample after induction; 9: 37 ℃, OD600=1.0, IPTG 1.0 mmol/L precipitation sample after induction; 10: 40 ℃, OD600=1.0, IPTG 1.0 mmol/L precipitate samples after induction |
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| 图 6 重组蛋白Bgl747的SDS-PAGE分析 Figure 6 SDS-PAGE analysis of recombinant protein Bgl747 注：M：蛋白Marker；1：含pET-28a空载体的大肠杆菌BL21(DE3)破碎液上清；2：含重组质粒pET-28a-Bgl747的大肠杆菌BL21(DE3)细胞破碎液上清；3：Bgl747纯蛋白 Note: M: Protein Marker; 1: Cell extract of E. coli BL21(DE3) harboring pET-28a; 2: E. coli BL21(DE3) cell disruption supernatant containing recombinant plasmid pET-28a-Bgl747; 3: Bgl747 pure protein |
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Bgl747的最适反应pH结果如图 7a所示，在pH为4.0时Bgl747酶活力最高，pH 2.0-4.0内仍有50%以上的活力，说明Bgl747是一种偏酸性的β-葡萄糖苷酶。pH稳定性如图 7a所示，Bgl747即使在pH 2.0-5.0的酸性条件下45 ℃孵育2 h仍有50%以上的活性，pH 8.0时可保留87%的活力，说明在酸碱环境下Bgl747具有较好的稳定性，尤其是在酸性条件下。
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| 图 7 Bgl747的最适反应条件及其稳定性 Figure 7 Optimal conditions and stability of Bgl747 |
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Bgl747的最适反应温度结果如图 7b所示，4-45 ℃时随着温度的逐渐升高，酶活力不断增加，45 ℃时达到最高酶活，温度大于45 ℃时活性逐渐减小，80 ℃条件下酶活力仍为77%。综上所述，Bgl747在45 ℃时具有最高酶活力，并且温度适用范围较广。温度稳定性结果如图 7b所示，Bgl747在45 ℃条件下稳定性最好；直到70 ℃时保温2 h仍存有80%以上的酶活力，展示出较好的热稳定性。
2.5.2 金属离子和化学试剂对酶活力的影响金属离子和化学试剂对Bgl747酶活力的影响如图 8所示。金属离子和化学试剂对Bgl747的酶活性均有不同程度的影响，其中1 mmol/L K+、1 mmol/L和10 mmol/L Fe2+、30%甲醇及乙醇、1 mmol/L和10 mmol/L的盐酸胍对酶活都有较明显的促进作用，而30% Triton X-100及10 mmol/L SDS酶活抑制作用较明显。其中，金属离子Fe2+的促进作用随着浓度的增加而增强；有机溶剂中的乙醇对酶分子表面进行亲水化作用增加了醇与水的结合能力以及与蛋白质间的相互作用，而使酶活性增加；阴离子表面活性剂SDS随着浓度的增加酶活性显著降低，其原因是SDS疏水性的脂肪族侧链与酶蛋白内部疏水区域的非极性基团相互作用，导致酶蛋白的微环境发生改变，从而影响蛋白酶的空间构象，致使酶变性失活。
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| 图 8 金属离子和化学试剂对Bgl747酶活力的影响 Figure 8 Effects of metal ions and reagents on activities of Bgl747 Note: *: P < 0.05 |
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以pNPG为底物Bgl747的比酶活达225.07 U/mg，根据图 9所示方程得出横纵坐标与曲线的交点，由此算出最大反应速率Vmax为547.23 μmol/(L·min)，米氏常数Km为0.268 mmol/L。
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| 图 9 Bgl747的动力学参数 Figure 9 Lineweaver-Burk plot for Bgl747 |
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如图 10所示，随着葡萄糖浓度的增加，Bgl747的酶活力逐渐减弱。当反应体系中葡萄糖浓度达到3 mol/L时，Bgl747的活性仅剩13%，说明高浓度葡萄糖对酶活有明显的抑制作用，但当葡萄糖浓度为1 mol/L时，Bgl747的酶活仍有50%以上。
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| 图 10 葡萄糖对Bgl747酶活力的影响 Figure 10 Effects of glucose on the activity for Bgl747 应pH为4.0，在酸性和碱性环境中均能保持一定的稳定性，尤其是在酸性条件下，因其等电点pI为5.5，属于酸性蛋白质，所以在酸性条件下能保持稳定的构象。体系pH 7.0时，Bgl酶活性处于不稳定的状态，其相对酶活力呈现下降的趋势。这是由于反应体系逐渐偏碱时，会对酶活性中心的必需基团具有一定的影响，削弱底物和酶的解离程度，从而破坏酶与底物间的结合和催化能力。pH为8.0-10.0时，稳定性逐渐增强，原因在于其的等电点是5.5，带负电的蛋白质在碱性环境中，由于电子的互斥而使蛋白质保持稳定构象，而当pH > 10.0时，蛋白质发生不可逆的变性而失活。酶学性质的研究表明，Bgl747具有相对较高的最适反应温度、热稳定性及酸碱稳定性，具有较好的工业应用前景。 |
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本研究利用底物七叶苷功能筛选法从玉米秸秆土壤中筛选出一株β-葡萄糖苷酶，其原理为β-葡萄糖苷酶将七叶苷分解为可与三价铁离子反应的七叶苷原，继而与Fe3+络合成黑色化合物。根据NCBI数据库中(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)的同源性分析，所筛选出来的β-葡萄糖苷酶属于BglB超家族。本实验通过构建重组质粒pET-28a-Bgl747并转入大肠杆菌BL21(DE3)中进行表达，经蛋白纯化试剂盒纯化获得纯蛋白。
重组β-葡萄糖苷酶Bgl747反应的最适温度为45 ℃，较优于来源于其他微生物的β-葡萄糖苷酶，例如最适温度为40 ℃且来源于链霉菌GXT6的β-葡萄糖苷酶BGL3-GXT6[8]，拥有44 ℃最适温度的bgl2238来源于宏基因组文库[9]，但低于嗜热微生物中的β-葡萄糖苷酶BglY，其最适反应温度为65 ℃[10]，也低于从嗜热淀粉芽孢杆菌(Bacillus thermoamylovorans)基因组中挖掘的β-葡萄糖苷酶Bgl52，其最适反应温度为70 ℃[11]。Bgl747具有较好的热稳定性，70 ℃时保温2 h仍存有80%以上的酶活力，具有较好稳定性，优于源自海洋链霉菌的r-BglNH和源于土壤宏基因组文库的Bgl1269，前者45 ℃下经1 h后酶活只剩40%[12]，后者45 ℃下仅经过0.5 h酶活只剩20%[13]；Bgl747的最适反
当以pNPG为底物时β-葡萄糖苷酶Bgl747的比酶活可达到225.07 U/mg，相比于其他来源的酶，其酶活力更具优势，例如比酶活为13 U/mg的来源于极端嗜热纤维素降解菌的β-葡萄糖苷酶[14]，比酶活为93 U/mg的来源于嗜碱性芽孢杆菌C-125的β-葡萄糖苷酶[15]。金属离子与化学试剂对Bgl747的酶活力有一定程度的影响，其中1 mmol/L K+、1 mmol/L和10 mmol/L Fe2+、30%甲醇、30%乙醇、1 mmol/L和10 mmol/L的盐酸胍对酶活都有较明显的促进作用，然而只有30% Triton X-100及蛋白质变性剂SDS对酶活有明显的抑制作用，添加其他金属离子和化学试剂时酶活均保持在50%以上，综上所述，β-葡萄糖苷酶Bgl747对金属离子及有机溶剂具有一定的耐受性，在工业上表现出良好的应用前景。
β-葡萄糖苷酶可以控制着纤维素酶水解反应过程的快慢，对产物葡萄糖尤为敏感。Bgl747虽然受到葡萄糖的反馈抑制，但只有对高浓度的葡萄糖表现出明显的抑制作用，当反应体系中葡萄糖的浓度为1 mol/L时，β-葡萄糖苷酶Bgl747的活性仍能保留50%以上，显示出其对葡萄糖具有一定的耐受性，为β-葡萄糖苷酶Bgl747在纤维素水解及其相关领域的应用奠定基础。
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