2021, Vol. 48扩展功能
文章信息
- 宋娟, 于佳慧, 李安南, 关梦铁, 耿彤彤, 张中义, 杨东辉, 马明
- SONG Juan, YU Jiahui, LI Annan, GUAN Mengtie, GENG Tongtong, ZHANG Zhongyi, YANG Donghui, MA Ming
- 非核糖体肽Skyllamycin B生物合成中Ⅰ型硫酯酶底物杂泛性的初步研究
- Characterization of the substrate promiscuity of type Ⅰ thioesterase in skyllamycin B biosynthesis
- 微生物学通报, 2021, 48(7): 2374-2388
- Microbiology China, 2021, 48(7): 2374-2388
- DOI: 10.13344/j.microbiol.china.210147
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文章历史
- 收稿日期: 2021-02-03
- 接受日期: 2021-05-04
非核糖体肽是由非核糖体肽合成酶(Nonribosomal Peptide Synthetase，NRPS)产生的结构复杂、种类繁多的天然产物，它们主要由微生物产生，是临床药物的重要来源，尤其在抗癌、抗感染方面有较多应用[1]。Skyllamycin B是从链霉菌Streptomyces sp. Acta 2897中分离得到的非核糖体肽类化合物(图 1)[2]，为生物膜形成抑制剂[3]。其同系物对血小板生长因子(Platelet- Derived Growth Factor，PDGF)具有强抑制作用[4]。Skyllamycin的生物合成基因簇以及生物合成途径相关研究已经被报道，其生物合成基因簇中的修饰基因sky32、sky37、sky39、sky40、sky41的敲除实验，证明了这几个修饰基因的功能[2]。此外，研究人员还通过点突变的方法阐明了P450酶(Sky32)催化产生3个氨基酸残基上β-OH的形成，解释了3个β-OH的生物合成顺序[5]；其NRPS最后一个模块中的Ⅰ型硫酯酶功能域(Thioesterase Domain，TE Domain)被推测催化分子内环化反应，产生Skyllamycin的环肽骨架[5]。
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| 图 1 Skyllamycin B的生物合成途径 Figure 1 The biosynthetic pathways of skyllamycin B |
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硫酯酶功能域在非核糖体肽生物合成过程中催化链状中间体从NRPS上释放下来[6]。在催化底物释放时，硫酯酶决定了形成链肽还是环肽以及环肽环合的位置。目前已有较多对NRPS中硫酯酶体外催化表征的报道，发现某些硫酯酶表现出了广泛的底物杂泛性，可以催化化学合成底物类似物产生一系列环肽分子[7-11]。由于链状肽类分子位置特异性的环化对于化学合成来说仍具有较大挑战性[12]，硫酯酶的底物杂泛性可被用来进行化学-酶联反应，以在温和条件下实现环肽分子的制备。本研究从合成Skyllamycin B的海洋链霉菌Streptomyces sp. PKU-MA01239基因组中克隆了NRPS中硫酯酶(Skyxy-TE)编码基因，在大肠杆菌中进行了过表达和后续的蛋白纯化。利用固相多肽合成的方法[13-15]合成Skyxy-TE的原始底物(Pre-Skyllamycin B)的类似物1和2 (图 2)。化合物1和2中肉桂酰片段(Cinnamoyl，Cin)可以模拟Pre-Skyllamycin B的脂酰片段(2-[1-(Z)-Propenyl]- Cinnamoyl，PrnCin)，C端连接N-乙酰基半胱氨(N-Acetylcysteaminyl，SNAC)基团以模拟肽基载体蛋白(Peptidyl Carrier Protein，PCP)的磷酸泛酰巯基乙胺基[16]。本研究初步表征了Skyxy-TE的底物杂泛性，为进一步利用Skyxy-TE开展化学-酶联反应以产生更多环肽分子提供依据。
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| 图 2 Skyxy-TE的催化功能及化合物1-4的结构 Figure 2 The catalytic function of Skyxy-TE and the structures of 1-4 注: A: Skyxy-TE催化原始底物示意图，PCP: 肽基载体蛋白; B: Skyxy-TE底物类似物1和环化产物3的化学结构; C: Skyxy-TE底物类似物2和环化产物4的化学结构。蓝色片段表示与原始底物有差异的片段，红色片段表示模拟PCP的磷酸泛酰巯基乙胺基 Note: A: Skyxy-TE catalyzed the cyclization of pre-skyllamycin B; PCP: Peptidyl carrier protein. B: The structures of Skyxy-TE's substrate mimic 1 and product 3. C: The structures of Skyxy-TE's substrate mimic 2 and product 4. Compared to pre-skyllamycin B, the different building blocks in 1 or 2 were labeled in blue. The N-acetylcysteaminyl moiety, which mimicks the phosphopantetheinyl moiety of PCP11-tethered native substrate, was labeled in red |
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KOD DNA聚合酶，东洋纺(上海)生物科技有限公司；Ssp Ⅰ酶，New England Biolab公司；T4聚合酶，北京索莱宝生物科技有限公司；E. coli Fast-T1，北京诺唯赞生物技术有限公司；E. coli BL21(DE3)，北京全式金生物技术公司；氨苄抗生素，生工生物工程(上海)股份有限公司；氨基酸及侧链带保护基团的氨基酸和2-氯三苯甲基氯树脂，上海吉尔生化有限公司；N, N-二异丙基乙胺(DIEA)、1-羟基苯并三唑(HOBt)、2-(7-偶氮苯并三氮唑)- N, N, N′, N′-四甲基脲六氟磷酸酯(HATU)、三氟乙酸(TFA)、二环己基碳二亚胺(DCC)、4-二甲氨基吡啶(DMAP)、N-乙酰基半胱氨(SNAC)和3-(N-吗啡啉)丙磺酸(MOPS)，北京百灵威科技有限公司；其余试剂均为分析纯。
高效液相色谱仪(HPLC)，安捷伦科技公司；中压液相色谱仪(MPLC)，北京创新通恒科技有限公司；制备型高效液相色谱仪(pre-HPLC)，科学系统公司；快速蛋白液相色谱仪(FPLC)，通用电气公司；NanoDrop 2000C分光光度计，赛默飞世尔科技公司；超声波细胞粉碎机，宁波新芝生物科技股份有限公司；高速冷冻离心机，湖南湘仪实验室仪器开发有限公司；SequoPure纯水仪，上海乐枫生物科技有限公司。
1.1.2 培养基LB液体培养基：胰蛋白胨10.0 g，氯化钠10.0 g，酵母提取物5.0 g，加蒸馏水至1 L，调节pH值至7.2-7.4，1×105 Pa灭菌20 min。
F液体培养基：酵母提取物1.0 g，胰蛋白胨5.0 g，牛肉膏1.0 g，FePO4 0.01 g，海盐33.0 g，加蒸馏水至1 L，调节pH值至7.4，1×105 Pa灭菌20 min。
对应固体培养基配制时加入琼脂18 g/L。
1.1.3 菌株和质粒Streptomyces sp. PKU-MA01239由本实验室从广西斜阳岛海绵中分离获得，通过16S rRNA基因测序鉴定为链霉菌属，储存于实验室菌种库。E. coli Fast-T1用于质粒构建，E. coli BL21(DE3) 用于蛋白表达。质粒pMCSG7携带Ampicillin抗性(ampR)基因作为表达载体[17]，质粒pMCSG7- Skyxy-TE为本工作构建，用于硫酯酶蛋白表达。
1.2 基因组测序及生物信息学分析将冻存于-80 ℃的Streptomyces sp. PKU- MA01239孢子取200 µL，分三区涂布于F固体培养基平板上，28 ℃培养5 d后挑取多个单克隆菌株接种于F液体培养基中，28 ℃、220 r/min培养3 d。参照文献[18]的方法对Streptomyces sp. PKU-MA01239进行基因组DNA的提取，质检合格后送交上海美吉生物医药科技有限公司，采用Illumina的HiSeq测序方法进行全基因组扫描和基因注释。从次级代谢产物生物合成基因簇中找到Skyllamycin基因簇，上传antiSMASH 5进行分析，并且通过在线ORFfinder和BLAST进行分析比对。
1.3 基因克隆和质粒构建Skyxy-TE的DNA片段从Streptomyces sp. PKU-MA01239的基因组DNA中扩增。表达基因扩增引物为Skyxy-TE-F (5′-TACTTCCAATCCAAT GCCAACGACACCGACGGCGACAC-3′)和Skyxy- TE-R (5′-TTATCCACTTCCAATGCTACTTGCTTG TTCCGAGCTTTTCGGC-3′)。采用KOD OneTM PCR Master Mix进行PCR扩增，PCR反应体系(50 µL)：Skyxy-TE-F和Skyxy-TE-R引物(10 μmol/L)各1.5 µL，基因组DNA 2.0 µL，2×PCR Master Mix 25 µL，ddH2O补齐至50 µL。PCR反应条件：98 ℃ 2 min；98 ℃ 10 s，65 ℃ 5 s，68 ℃ 30 s，共35个循环；68 ℃ 5 min；4 ℃保存。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳检测后回收备用。通过Ligation Independent Cloning (LIC)方法[17]引入DNA片段至pMCSG7载体中，具体操作为：质粒pMCSG7用Ssp Ⅰ酶消化3 h，之后使用凝胶电泳进行纯化，纯化所得线性化载体在dGTP和T4聚合酶存在情况下25 ℃处理35 min，75 ℃加热20 min；PCR产物回收所得Skyxy-TE片段在dCTP和T4聚合酶存在情况下25 ℃处理35 min，再75 ℃加热20 min；处理后的线性化载体质粒和目的基因片段在室温下混合，冰上孵育30 min，并转化至E. coli Fast-T1。使用引物T7 (5′-TAAT ACGACTCACTATAGGG-3′)和T7 ter (5′-TGCTA GTTATTGCTCAGCGG-3′)进行携带目的基因的质粒pMCSG7-Skyxy-TE的测序确认，测序由北京睿博兴科生物技术有限公司完成。
1.4 Skyxy-TE蛋白纯化测序成功的质粒pMCSG7-Skyxy-TE转入E. coli BL21(DE3)中，将平板上的单克隆菌点接入2 mL的LB液体培养基中，于37 ℃、220 r/min条件下培养4-5 h后，再转接入500 mL含终浓度为100 μg/mL氨苄抗生素的LB液体培养基中，于37 ℃、220 r/min条件下培养，直到菌落OD600达到0.6左右。向培养基中加入最终浓度为0.2 mmol/L的异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)，于18 ℃条件下诱导，并于220 r/min持续培养18 h。培养结束后，通过4 ℃、4 000 r/min离心10 min收取菌体，并在破碎缓冲液(100 mmol/L Tris-HCl，300 mmol/L NaCl，15 mmol/L Imidazole，10%甘油，pH 8.0)中重悬菌体，菌体于4 ℃、700 W的条件下，以工作2 s、间歇2 s共30 min完成超声菌体破碎，之后于4 ℃、13 000 r/min高速离心50 min后去除沉淀，上清液通过0.45 μm滤膜过滤。含有Skyxy-TE蛋白的上清液使用Ni-NTA亲和色谱进行纯化。纯化使用缓冲溶液A (50 mmol/L Tris-HCl，300 mmol/L NaCl，20 mmol/L Imidazole，pH 8.0)和缓冲溶液B (50 mmol/L Tris-HCl，300 mmol/L NaCl，200 mmol/L Imidazole，pH 8.0)，蛋白在50%缓冲溶液B的条件下洗脱出来。纯化所得Skyxy-TE蛋白进行浓缩并使用PD-10脱盐层析柱进行缓冲液置换，置换到反应缓冲液(20 mmol/L Tris，100 mmol/L NaCl，pH 8.0)中。使用NanoDrop 2000C在280 nm处测试Skyxy-TE蛋白浓度，并在液氮中快速冷冻后储存于-80 ℃冰箱，用于酶催化反应。Skyxy-TE蛋白的分子量和纯度使用SDS-PAGE进行分析，带上6×His标签表达蛋白，分子量为32.7 kD。
1.5 固相多肽合成法合成底物1a和2a称取200 mg (载样量为0.948 mmol/g) 2-氯三苯甲基氯树脂至固相合成反应管中，加入2 mL二氯甲烷(DCM)浸泡溶胀15 min，用DCM冲洗3次，抽干待用。向树脂中加入含有134 mg (0.379 2 mmol) Fmoc-D-Leu-OH和132 μL (0.758 4 mmol) DIEA的2 mL DCM溶液，置恒温振荡器中，常温反应40 min，反应完毕抽干反应液，用N, N-二甲基甲酰胺(DMF)洗涤树脂3次；向合成管中加入2 mL封闭试剂(DMF: MeOH: DIEA= 17:2:1，体积比)，室温振荡30 min，合成反应管上端用吸耳球加压过滤掉溶剂，用DMF洗涤树脂3次，最后一次取少量树脂，用正丁醇茚三酮溶液检测显无色；之后进行保护基团Fmoc的去除，加入2 mL 20%哌啶/DMF溶液反应20 min，脱去亮氨酸上N端的Fmoc保护，用DCM、DMF洗涤树脂各3次，最后一次用DMF洗涤，之后取少量树脂，用正丁醇茚三酮溶液检测显示有色。重复上述缩合方法，按照氨基酸序列将Fmoc-氨基酸(0.379 2 mmol)、HOBt (0.379 2 mmol)、HATU (0.379 2 mmol)和DIEA (0.758 4 mmol)溶解于2 mL DMF中，依次偶联Fmoc-D-Leu-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-D-Trp-OH、Fmoc-Tyr(OMe)- OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Thr(tBu)- OH、Cinnamic acid。具体合成路线见图 3A。氨基酸连接完毕，最后一步不进行保护基团叔丁基的去除，将中间产物1a从树脂释放下来。用DCM冲洗后，向合成管中加入2 mL TFA-DCM (2:98，体积比)切割试剂振荡反应10 min，过滤，收集滤液，反复3次，合并收集滤液得到粗品多肽，浓缩干燥后用甲醇溶解粗品，采用ClaricepTM i-Series C18 Cartridge (40 g，20-35 μm，100 Å)色谱柱进行MPLC分离纯化，流动相A为水、B为甲醇，线性梯度洗脱(70%→100% B，体积分数，50 min)，流速10 mL/min，检测波长为210 nm。对最终纯化产品进行LC-MS鉴定，得到1a (150 mg)。
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| 图 3 底物类似物1和2的合成 Figure 3 The synthesis of substrate mimics 1 and 2 注: A: 底物1的合成示意图; B: 底物2的合成示意图 Note: A: The synthesis of compound 1; B: The synthesis of compound 2 |
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2a的合成采用相同的方法进行，在进行第5和第7个氨基酸缩合的时候，分别使用Fmoc-Tyr(tBu)-OH和Fmoc-(OMe)Tyr-OH，具体合成路线见图 3B。氨基酸连接完毕，最后一步不进行保护基团叔丁基的去除，将中间产物2a从树脂释放下来。用DCM冲洗后，向合成管中加入2 mL TFA-DCM (2:98，体积比)切割试剂振荡反应10 min，过滤，收集滤液，反复3次，合并收集滤液得到粗品多肽，浓缩干燥后用甲醇溶解粗品，采用ClaricepTM i-Series C18 Cartridge (40 g，20-35 μm，100 Å)色谱柱进行MPLC分离纯化，流动相A为水、B为甲醇，线性梯度洗脱(70%→100% B，体积分数，50 min)，流速10 mL/min，检测波长为210 nm。对最终纯化产品进行LC-MS鉴定，得到2a (180 mg)。
1.6 化合物1和2的合成和纯化向反应器中加入含有150 mg 1a、30 mg (0.1 mmol) SNAC、30 mg (0.1 mmol) DCC、1.5 mg (0.1 mmol) DMAP的2 mL DMF溶液，在45 ℃油浴、600 r/min条件下反应12 h。LC-MS对1b的生成进行监测，直至反应不再进行，将反应体系在氮气下吹干，加入2 mL脱保护试剂TFA-DCM (95:5，体积比)，进行氨基酸侧链保护基团叔丁基的去除，常温搅拌3 h后，在氮气下去除溶剂，得到黄色油状物，合成过程如图 3A所示。黄色油状物通过MPLC分离，流动相A为水、B为甲醇，线性梯度洗脱(20%→90% B，体积分数，30 min)，流速10 mL/min，检测波长为210 nm，目标馏分进行pre-HPLC纯化，YMC-Pack ODS-A column (5 μm，250 mm×10 mm)色谱柱，乙腈-含0.1%甲酸的水(45:55，体积比)等度洗脱，流速2 mL/min，检测波长210 nm，得到底物类似物1 (20 mg)。化合物2采用同样的方法进行，如图 3B所示，最终得到底物类似物2 (15 mg)。
1.7 Skyxy-TE体外催化将50 µmol/L终浓度的Skyxy-TE蛋白及终浓度为500 μmol/L的化合物1和2于反应缓冲液(25 mmol/L MOPS，pH 7.0)中混匀，在28 ℃条件下反应30 min；之后加入100 μL甲醇终止反应，并于13 000 r/min高速离心10 min，取上清进行HPLC检测，检测结果如图 4B所示。以沸水煮沸10 min的变性蛋白作为阴性对照。催化新产生的色谱峰经LC-MS确认，检测结果如图 4C所示。
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| 图 4 Skyxy-TE蛋白SDS-PAGE分析及体外催化反应的HPLC和LC-MS分析 Figure 4 The SDS-PAGE analysis of Skyxy-TE and HPLC/LC-MS analysis of enzymatic reactions 注: A: 纯化蛋白SDS-PAGE分析图; B: 体外酶活反应HPLC图; C: 化合物1-4的高分辨质谱图 Note: A: The SDS-PAGE analysis of Skyxy-TE; B: The HPLC analysis of Skyxy-TE reactions with substrates 1 and 2; C: The results of LC-MS analysis of compounds 1-4 |
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将体外酶催化大量反应混合体系进行pre-HPLC纯化，洗脱溶剂为乙腈-含0.1%甲酸的水(45:55，体积比)，色谱柱为YMC-Pack ODS-A Column (5 μm，250 mm×10 mm)，检测波长210 nm，流速2 mL/min，得到化合物3 (5.0 mg)和化合物4 (5.5 mg)。
1.9 HPLC、MS及NMR分析条件常规HPLC分析条件为：A相为水(0.1%甲酸，体积分数)，B相为乙腈，乙腈洗脱梯度为0-3 min (5%，体积分数)，3.0-23.0 min (5%→100%，体积分数)，23.0-28.0 min (100%，体积分数)；流速1 mL/min；检测波长190-600 nm；柱温25 ℃，色谱柱为Agilent Extend-C18 (5 μm，250 mm×4.6 mm)。高分辨液质联用仪为岛津离子阱飞行时间质谱仪(IT-TOF)，分析采用负离子模式。核磁数据在Bruker Avance Ⅲ 400和600 MHz核磁共振仪上采集，核磁样品溶剂DMSO-d6。
2 结果与分析 2.1 非核糖体肽Skyllamycin B生物合成基因簇分析本课题组已经构建了包含海洋、土壤、植物共生等来源的细菌菌种库(超过3 000株)，前期从一株海洋来源Streptomyces sp. PKU-MA01239中发现了一个非核糖体肽Skyllamycin B，并通过基因组测序和生物信息学分析确定了其生物合成基因簇，与已报道的来源于Streptomyces sp. Acta 2897的Skyllamycin生物合成基因簇几乎完全相同[19]。从推测的Skyllamycin B生物合成途径可知(图 1)，在NRPS的最后一个模块含有一个TE功能域，负责整个肽链的释放以及环化(图 2A)。TE功能域表现出的底物杂泛性已被用于化学-酶联反应以生成环肽衍生物。例如Tyrocidine生物合成中的TE结构域Tyrocidine-TE可以接受来自固相多肽合成的模拟底物，包括不同氨基酸替换的线性肽[20-21]、带修饰的线性肽[22-23]或者不同长度的线性肽[24]都能够催化环化。为了探讨Skyllamycin生物合成中TE的底物杂泛性，我们对发现的Streptomyces sp. PKU-MA01239中Skyllamycin B生物合成中的TE (Skyxy-TE)的编码基因进行了克隆和表达，对蛋白进行了纯化。另外合成了2个Skyxy-TE原始底物(Pre-Skyllamycin B)的类似物1和2 (图 2)，以初步探究Skyxy-TE的催化活性和底物杂泛性。
2.2 化合物1和2的固相多肽合成和结构鉴定按照固相多肽合成方法(图 3)，我们合成了化合物1和2。化合物1和2的结构通过NMR和HRESIMS等分析得到了确证(表 1)。
| Position | 1 | 2 | 3 | 4 | |||
| δH (J in Hz) | δH (J in Hz) | δH (J in Hz) | δC, type | δH (J in Hz) | δC, type | ||
| Cin | |||||||
| 1 | 166.6, C | 166.4, C | |||||
| 2 | 6.97, d* (16.0) | 6.95, d* (15.8) | 6.96, d* (15.8) | 121.1, CH | 6.95, d* (16.8) | 121.1, CH | |
| 3 | 7.41, m | 7.41, m* | 7.54, m* | 140.3, CH | 7.55, d* (16.1) | 140.3, CH | |
| 1′ | 134.5, C | 134.6, C | |||||
| 2′, 6′ | 7.57, d (7.0) | 7.56, d (6.8) | 7.53, m* | 127.7, CH | 7.54, m* | 127.7, CH | |
| 3′, 5′ | 7.44, m | 7.44, m | 7.41, m* | 128.9, CH | 7.41, m* | 128.9, CH | |
| 4′ | 7.39, m | 7.39, m* | 7.39, m* | 129.8, CH | 7.39, m* | 129.8, CH | |
| 1Thr | |||||||
| NH | 8.06, d# (8.5) | 8.09, d# (8.4) | 8.75, s | 8.76, s* | |||
| α | 4.42, m* | 4.46, m* | 4.90, m | 58.0, CH | 4.89, m | 57.7, CH | |
| β | 4.09, m | 4.06, m* | 5.09, t (5.6) | 69.9, CH | 5.07, t (5.8) | 69.8, CH | |
| γ | 1.08, d (6.2) | 1.06, d (6.3) | 1.12, d (5.5) | 16.5, CH3 | 1.07, d (6.4) | 16.5, CH3 | |
| C=O | 171.0, C | 171.2, C | |||||
| 2Ala | |||||||
| NH | 8.19, d# (6.0) | 8.21, d*# (7.8) | 8.45, br s* | 8.45, br s | |||
| α | 4.25, t (7.0) | 4.27, t (7.2) | 4.07, m | 50.0, CH | 4.06, m | 50.0, CH | |
| β | 1.23, d (7.0) | 1.22, d (7.1) | 1.24, d (7.5) | 17.0, CH3 | 1.24, d (7.2) | 17.0, CH3 | |
| C=O | 171.8, C | 171.6, C | |||||
| 3Asp | |||||||
| NH | 7.72, d# (7.0) | 7.70, br d# (6.4) | 7.81, br s | 7.75, br s* | |||
| α | 4.34, m* | 4.42, m* | 4.51, m* | 52.8, CH | 4.54, m* | 50.2, CH | |
| β | 2.47, m#; 2.71, m# | 2.46, m#; 2.60, m*# | 2.69, m; 2.77, m* | 37.7, CH2 | 2.61, m*; 2.67, m | 38.6, CH2 | |
| γ C=O | 170.8, C | 170.9, C | |||||
| C=O | 169.7, C | 169.7, C | |||||
| 4Gly | |||||||
| NH | 7.82, br t# (6.2) | 7.80, br t# (5.4) | 7.77, br s | 7.78, br s* | |||
| α | 3.54, m*# | 3.41, m*#; 3.63, m*# | 3.40, m*; 3.87, m | 41.9, CH2 | 3.36, m; 3.89, m | 41.7, CH2 | |
| C=O | 168.7, C | 168.7, C | |||||
| 5Phe/Tyr | |||||||
| NH | 8.16, d# (7.7) | 8.16, br d*# (7.4) | 7.93, br s | 7.89, br s | |||
| α | 4.61, m | 4.55, m | 4.49, m* | 49.4, CH | 4.44, m* | 53.1, CH | |
| β | 2.89, m*#; 2.93, m# | 2.76, m#; 2.80, m# | 2.58, m; 2.75, m* | 36.3, CH2 | 2.44, m; 2.61, m* | 35.5, CH2 | |
| 1′ | 137.7, C | 127.8, C | |||||
| 2′6′ | 7.20, m* | 7.03, br d (8.4) | 7.23, m* | 129.3, CH | 7.04, d (8.3) | 130.2, CH | |
| 3′5′ | 7.19, m* | 6.67, d (8.0) | 7.15, m* | 128.1, CH | 6.60, d (8.3) | 114.9, CH | |
| 4′ | 7.15, m | 7.14, m* | 126.4, CH | 155.9, CH | |||
| C=O | 170.8, C | 170.9, C | |||||
| 6Pro | |||||||
| α | 4.34, m* | 4.31, m | 4.18, m* | 60.0, CH | 4.19, m* | 59.9, CH | |
| β | 1.69, m; 1.85, m | 1.65, m; 1.87, m | 1.68, m*; 1.79, m* | 28.4, CH2 | 1.71, m; 1.81, m* | 28.4, CH2 | |
| γ | 1.72, m; 1.75, m | 1.70, m; 1.74, m | 1.75, m*; 1.77, m* | 24.3, CH2 | 1.79, m*; 1.80, m* | 24.3, CH2 | |
| δ | 3.58, m; 3.62, m# | 3.55, m; 3.63, m*# | 3.29, m*; 3.56, m* | 46.8, CH2 | 3.44, m; 3.63, m | 46.9, CH2 | |
| C=O | 171.1, C | 170.1, C | |||||
| 7Tyr/Tyr(OCH3) | |||||||
| NH | 8.24, s# | 8.23, s# | 7.05, br s* | 7.04, br s* | |||
| α | 4.42, m* | 4.40, m* | 4.50, m* | 53.0, CH | 4.54, m* | 52.7, CH | |
| β | 2.55, m*#; 2.76, m# | 2.60, m*#; 2.65, m# | 2.43, m*; 2.72, m* | 37.2, CH2 | 2.44, m; 2.77, m | 36.9, CH2 | |
| 1′ | 126.6, C | 128.2, C | |||||
| 2′6′ | 6.68, d (8.2) | 6.62, d (8.4) | 6.40, br d (6.4) | 130.3, CH | 6.36, d (7.3) | 130.4, CH | |
| 3′5′ | 6.51, d (7.6) | 6.46, d (8.5) | 6.29, d (6.4) | 114.5, CH | 6.21, d (7.1) | 112.8, CH | |
| 4′ | 155.7, C | 157.4, C | |||||
| 4′-OCH3 | 3.58, s | 3.52, s | 54.7, CH3 | ||||
| C=O | 170.1, C | 170.1, C | |||||
| 8D-Trp | |||||||
| NH | 8.12, d# (8.1) | 8.14, br d*# (3.9) | 8.49, br d (6.5) | 8.56, s | |||
| α | 4.47, m | 4.49, m* | 4.47, m* | 53.6, CH | 4.45, m* | 53.7, CH | |
| β | 2.99, m; 3.20, m | 2.98, m; 3.20, m | 2.94, m; 3.09, m | 27.6, CH2 | 2.95, m; 3.07, m | 27.6, CH2 | |
| 1-NH | 10.82, s | 10.83, s | 10.83, s | 10.86, s | |||
| 2 | 7.20, m* | 7.24, m | 7.23, m* | 124.3, CH | 7.27, br s | 124.4, CH | |
| 3 | 109.9, C | 109.9, C | |||||
| 4 | 127.1, C | 127.1, C | |||||
| 5 | 7.63, d (8.0) | 7.66, d (7.7) | 7.67, d (7.8) | 118.7, CH | 7.69, d (7.8) | 118.9, CH | |
| 6 | 6.99, t* (7.8) | 6.99, t* (7.2) | 6.97, t* (7.2) | 118.2, CH | 6.99, t (7.6) | 118.2, CH | |
| 7 | 7.06, t (7.9) | 7.07, t (7.2) | 7.06, t* (7.4) | 120.9, CH | 7.08, t (7.3) | 120.9, CH | |
| 8 | 7.31, d (8.0) | 7.32, d (8.1) | 7.30, d (8.0) | 111.3, CH | 7.32, d (8.0) | 111.4, CH | |
| 9 | 136.2, C | 136.3, C | |||||
| C=O | 172.3, C | 172.4, C | |||||
| 9Gly | |||||||
| NH | 8.31, br t# (5.1) | 8.38, br t# (4.5) | 8.62, s | 8.74, s* | |||
| α | 3.74, m*# | 3.75, m*# | 3.53, m*; 4.26, m | 41.8, CH2 | 3.55, m*; 4.22, m* | 41.8, CH2 | |
| C=O | 168.7, C | 169.7, C | |||||
| 10D-Leu | |||||||
| NH | 7.87, d# (8.3) | 7.86, d# (7.7) | 8.12, br s | 8.18, br s | |||
| α | 4.42, m* | 4.43, m* | 4.33, m | 52.1, CH | 4.35, m | 52.0, CH | |
| β | 1.47, m; 1.56, m | 1.48, m; 1.53, m | 1.38, m; 1.48, m* | 40.7, CH2 | 1.34, m; 1.43, m | 41.0, CH2 | |
| γ | 1.66, m* | 1.60, m* | 1.65, m | 23.8, CH | 1.62, m | 23.7, CH | |
| δ | 0.87, m* | 0.87, m* | 0.83, d (6.4) | 23.0, CH3 | 0.82, d (6.5) | 23.1, CH3 | |
| 0.87, m* | 0.87, m* | 0.80, d (6.4) | 21.3, CH3 | 0.80, d (6.5) | 21.3, CH3 | ||
| C=O | 172.3, C | 172.4, C | |||||
| 11D-Leu | |||||||
| NH | 8.48, d# (7.6) | 8.49, d# (7.0) | 8.27, br d (5.2) | 8.34, br s | |||
| α | 4.34, m* | 4.35, m* | 4.18, m* | 50.2, CH | 4.17, m* | 50.1, CH | |
| β | 1.50, m; 1.60, m | 1.48, m; 1.57, m | 1.50, m*; 1.57, m* | 38.1, CH2 | 1.50, m; 1.55, m* | 38.1, CH2 | |
| γ | 1.66, m* | 1.60, m* | 1.56, m* | 24.2, CH | 1.55, m* | 24.2, CH | |
| δ | 0.87, m* | 0.87, m* | 0.77, br d (4.4) | 22.8, CH3 | 0.76, d (4.4) | 22.8, CH3 | |
| 0.80, d (6.4) | 0.80, m* | 0.73, d (5.7) | 20.6, CH3 | 0.73, d (5.8) | 20.6, CH3 | ||
| C=O | 171.1, C | 171.1, C | |||||
| SNAC | |||||||
| NH | 8.01, t (5.4) | 8.01, br t (5.1) | |||||
| α-CH2 | 3.11, m | 3.11, m | |||||
| β-CH2 | 2.83, m | 2.84, m | |||||
| CH3 | 1.77, s | 1.77, s | |||||
| Note: *: These signals overlapped with others; #: These signals are exchangeable | |||||||
化合物1：白色粉末；HRESIMS数据为m/z：1 468.661 1 [M-H]- (图 4C)，与理论分子量1 468.661 1相符合；分子式：C74H95N13O17S。1H NMR (DMSO-d6，400 MHz)在最低场δH 10.8 ppm左右为色氨酸上的吲哚氮原子连接的活泼氢信号，在低场区δH 7.6-8.6 ppm存在11个酰氨基活泼氢信号，与11个酰胺键对应(10个氨基酸和1个SNAC)。在芳香区δH 6.2-7.7 ppm有19个氢信号，包含14个苯环基团氢信号(2个单取代苯和1个对取代苯中的氢信号)和5个吲哚基团上的氢信号；另外，该区域还有2个反式双键的特征氢信号(J=16.0 Hz)。往高场区δH 3.3-4.7 ppm主要为氨基酸α碳上氢信号，δH 2.3-3.3 ppm主要为氨基酸β碳上氢信号，δH 1.3-2.0 ppm主要为氨基酸γ碳上氢信号，高场区δH有6个裂分为双峰的氨基酸上甲基氢信号，分别为δH 1.23 (3H)、1.08 (3H)、0.87 (3H) (3个重叠)、0.80 (3H) ppm，对应1个丙氨酸、1个苏氨酸和2个亮氨酸中的甲基。δH 1.77 ppm处单峰为乙酰基中甲基氢信号，2.83 ppm和3.11 ppm分别为β和α碳上氢信号，为SNAC氢信号。将化合物1的氢谱信号进行了归属(表 1)，确认化合物1合成无误。
化合物2：白色粉末；HRESIMS数据为m/z：1 498.670 4 [M-H]- (图 4C)，与理论分子量1 498.671 6相符合，分子式：C75H97N13O18S。1H NMR (DMSO-d6，400 MHz)在最低场δH 10.8 ppm左右为色氨酸上的吲哚氮原子连接活泼氢信号，在低场区δH 7.6-8.6 ppm存在11个酰氨基活泼氢信号，与11个酰胺键对应(10个氨基酸和1个SNAC)。在芳香区δH 6.2-7.7 ppm有18个氢信号，包含13个苯环基团氢信号(1个单取代苯和2个对取代苯中的氢信号)和5个吲哚环基团上烯烃氢信号；另外，还有2个反式双键的特征氢信号(J=15.8 Hz)。往高场区δH 3.3-4.7 ppm主要为氨基酸α碳上氢信号，以及苯环对位取代的甲氧基氢信号(3.58 ppm)；δH 2.3-3.3 ppm主要为氨基酸β碳上氢信号，δH 1.3-2.0 ppm主要为氨基酸γ碳上氢信号，高场区δH有6个裂分为双峰的氨基酸上甲基氢信号，分别为1.22 (3H)、1.06 (3H)、0.87 (3H) (3个重叠)和0.80 (3H) ppm，对应1个丙氨酸、1个苏氨酸和2个亮氨酸中的甲基。同样，SNAC上氢信号表明1.77 ppm处单峰为乙酰基中甲基，2.84 ppm和3.11 ppm分别为β和α碳上氢。将化合物2的氢谱信号进行了归属(表 1)，确认化合物2合成无误。
2.3 Skyxy TE的体外催化基于质粒pMCSG7构建了包含Skyxy-TE编码基因的表达质粒pMCSG7-Skyxy-TE，经过在大肠杆菌BL21中的诱导表达以及镍离子亲和层析纯化后，得到了可溶的Skyxy-TE蛋白，经SDS-PAGE分析纯度高(图 4A)。以固相多肽方法合成的化合物1和2作为底物分别进行Skyxy-TE体外酶催化实验，通过HPLC检测，发现2个底物的反应体系中产生了新的化合物峰(图 4B)，经HRESIMS检测为环化产物(图 4C)，而高温变性的Skyxy-TE反应体系中未检测到环化产物(图 4B)。
2.4 化合物3和4的结构鉴定催化形成的2个产物3和4为底物类似物1和2脱去SNAC后C端亮氨酸羧基和N端苏氨酸羟基脱水形成酯键的环肽，是Skyllamycin B类似物。经过1D、2D NMR以及HRESIMS等分析，确证了化合物3和4的化学结构。
化合物3：白色粉末；HRESIMS数据为m/z：1 349.620 2 [M-H]- (图 4C)，与理论分子量1 349.620 6相符合；分子式：C70H86N12O16。1H NMR所有氨基酸信号基本与化合物1对应，在最低场δH 10.8 ppm左右为色氨酸上的吲哚氮原子连接活泼氢信号，在低场区δH 7.6-8.6 ppm存在10个氨基活泼氢信号，与10个酰胺键对应。在芳香区δH 6.2-7.7 ppm有19个氢信号，包含14个苯环基团氢信号(2个单取代苯和1个对取代苯中的氢信号)和5个吲哚环氢信号；另外，该区域还有2个是反式双键的特征氢信号(J=15.8 Hz)。1H NMR的高场区信号重叠严重，根据COSY、HSQC和HMBC实验对剩余氢信号进行了归属。13C NMR在低场区δC 165-175 ppm有13个羰基碳信号，对应肽链骨架上的11个酰胺基、1个酯基以及1个Asp侧链羧基基团的羰基。在芳香区δC 105-158 ppm有22个碳信号，结合1H NMR确认的信息，可推测有12个碳信号属于苯环，8个属于吲哚环，2个是碳-碳双键的信号。通过Hγ-1Thr (δH 1.12)和Hα-11Leu (δH 4.18)、Hβ-1Thr (δH 5.09)和Hα-11Leu (δH 4.18)、H3-Cin (δH 7.54)和Hβ-11Leu (δH 1.50，1.57)、H3-Cin (δH 7.54)和Hδ-11Leu (δH 0.77)均有NOESY相关等，可知亮氨酸与苏氨酸相连，说明化合物3为环肽。通过1H NMR和13C NMR谱图的分析(表 1)，结合COSY、HSQC、HMBC和NOESY数据(其COSY、HMBC和NOESY相关见图 5)，最终确定了化合物3的结构。
|
| 图 5 化合物3和4的主要COSY、HMBC和NOESY相关 Figure 5 The key COSY, HMBC and NOESY correlations of compounds 3 and 4 |
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化合物4：白色粉末；HRESIMS数据为m/z：1 379.630 9 [M-H]- (图 4C)；与理论分子量1 379.631 2相符合；分子式：C71H88N12O17。1H NMR所有氨基酸信号基本与化合物2吻合，在最低场δH 10.8 ppm左右为色氨酸上的吲哚氮原子连接活泼氢信号，在低场区δH 7.6-8.6 ppm存在10个氨基活泼氢信号，与10个酰胺键对应。在芳香区δH 6.2-7.7 ppm有18个氢信号，包含13个苯环基团氢信号(1个单取代苯和2个对取代苯中的氢信号)和5个吲哚环氢信号；另外，还有2个反式双键的特征氢信号(J=16.8 Hz)。1H NMR的高场区信号重叠严重，结合二维谱图COSY、HSQC、HMBC和NOESY对剩余氢信号进行了归属。13C NMR在低场区δC 165-175 ppm有13个羰基碳信号，对应肽链骨架上的11个酰胺基、1个酯基以及1个Asp侧链羧基基团的羰基。在芳香区δC 105-158 ppm有22个碳信号，可推测有12个碳信号属于苯环，8个属于吲哚环，剩下的2个是碳-碳双键的信号。同样通过Hβ-1Thr (δH 5.07)和Hα-11Leu (δH 4.17)、Hγ-1Thr (δH 1.07)和Hα-11Leu (δH 4.17)、H3-Cin (δH 7.55)和Hβ-11Leu (δH 1.50, 1.55)、H3-Cin (δH 7.55)和Hδ-11Leu (δH 0.76)均有NOESY相关等，可知C端亮氨酸与N端苏氨酸通过形成酯键相连，证明化合物4为环肽。通过1H NMR和13C NMR归属(表 1)，结合COSY、HSQC、HMBC和NOESY数据(其COSY、HMBC和NOESY相关见图 5)，最终确定了化合物4的结构。
3 讨论与结论以体外纯化的硫酯酶作为生物催化剂催化化学合成的线状肽类底物类似物以产生新颖非核糖体肽的研究已经取得了引人瞩目的成功。在这些研究中，硫酯酶作为生物催化剂所最需要的特性——宽泛的底物杂泛性被不断地证实[22-25]。随着酶工程的发展，越来越多的学者尝试利用化学-酶联法进行线性多肽体外环化[26-27]。许多大环抗生素，包括Tyocidine A[20-25]、Gramicidin S[28]和Surfactin A[29]等，其生物合成中硫酯酶功能域对固相有机合成底物类似物具有广泛的催化活性。这些研究表明，与化学合成相比，酶催化方法显示出温和条件下位置选择性的高效合成优势。
本研究中，我们从中国广西斜阳岛海绵中分离所得链霉菌Streptomyces sp. PKU-MA01239的天然产物生物合成基因簇中定位Skyllamycin B生物合成基因簇，找到位于最后一个模块中C末端的Ⅰ型硫酯酶Skyxy-TE。我们运用固相多肽合成法合成Skyxy-TE的2个底物类似物1和2，以化合物1和2为底物，纯化Skyxy-TE蛋白开展了体外催化实验，结果表明Skyxy-TE能够识别底物类似物并且形成环化产物。体外催化反应累积制备所得化合物3和4，其结构经NMR和HRESIMS分析得以确证，为新的Skyllamycin类环肽。此结果显示尽管底物类似物1和2在多个结构片段上与原始底物具有差异，但Skyxy-TE仍能在体外高效催化环肽的生成。其表现出的底物杂泛性为将来进一步开发化学-酶联反应体系以绿色、高效制备药用功能环肽分子打下了基础。
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