2021, Vol. 48扩展功能
文章信息
- 黄旖旎, 关洪鑫, 欧阳松应
- HUANG Yini, GUAN Hongxin, OUYANG Songying
- 嗜肺军团菌调节宿主泛素化途径的效应因子及其分子机制研究进展
- Effector and molecular mechanism of Legionella pneumophila regulating host ubiquitination pathway: a review
- 微生物学通报, 2021, 48(6): 2155-2169
- Microbiology China, 2021, 48(6): 2155-2169
- DOI: 10.13344/j.microbiol.china.200972
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文章历史
- 收稿日期: 2020-09-30
- 接受日期: 2020-12-12
- 网络首发日期: 2021-01-18
2. 福建师范大学南方生物医学研究中心 福建 福州 350117
2. Fujian Normal University, Biomedical Research Center of South China, Fuzhou, Fujian 350117, China
泛素化(Ubiquitination)是一种真核细胞内广泛存在的蛋白质修饰过程，在细胞生命周期各个方面都发挥重要作用。泛素化可调控蛋白质的稳定性、定位以及互作，而且参与转录调控、细胞生长及凋亡、囊泡运输等生理过程[1-2]。最常见的泛素化途径是由三级酶联反应实现的经典泛素化途径：首先，E1泛素激活酶(Ubiquitin-Activating Enzyme，简称E1s)利用ATP提供的能量催化泛素(Ubiquitin，Ub)分子C端赖氨酸(Lys)残基的羧基基团与自身的半胱氨酸(Cys)残基的巯基基团形成高能硫酯键，从而活化泛素分子；然后，激活的泛素分子再通过转硫醇作用连接至E2泛素结合酶(Ubiquitin-Conjugating Enzymes，简称E2s)的Cys残基上；接着在E3泛素连接酶(Ubiquitin-Ligase Enzymes，简称E3s)作用下，泛素分子的羧基末端与靶蛋白Lys残基的ε-氨基之间形成异肽键而将泛素分子转移到靶蛋白上[3]。另外，被泛素化修饰的蛋白质还可以被一类称为去泛素化酶(Deubiquitinases，DUBs)的蛋白质催化，DUBs催化裂解泛素与靶蛋白之间的酯键、肽键或异肽键，进而将泛素从底物蛋白上切下，并将泛素化的底物还原为其原始状态，使泛素化途径成为一个可逆的过程[4]。
原核细胞不具有编码泛素分子的基因，因此，细菌缺乏典型的泛素化系统[5]。许多病原菌能够有效地“劫持”宿主泛素化系统并据为己用，以成功逃避宿主免疫监视并在宿主细胞内进行复制[6]。嗜肺军团菌(Legionella pneumophila)作为一种需氧革兰氏阴性杆菌，兼性寄生于人类单核和巨噬细胞内，引起获得性非典型肺炎[7]。其在感染宿主时，可以通过特有的Dot/Icm Type-IVB (Defective Organelle Trafficking/Intracellular Multiplication，Dot/Icm)分泌系统向宿主胞浆内分泌多达300余种的效应因子，这些效应因子的功能包括形成感染囊泡LCV (Legionella-Containing Vacuole)[8]、抑制宿主免疫信号传导[9]、“劫持”宿主胞内重要调控蛋白[10-11]以及诱导宿主细胞的凋亡和裂解等[12-13]。此外，研究表明嗜肺军团菌效应蛋白可以通过不同方式调控和利用宿主泛素化系统，这些效应因子或是通过模仿经典的泛素化机制进行调控，或是利用全新的模式发挥作用。一些新型泛素化途径的发现表明军团菌效应因子泛素化调控途径比想象中更加丰富和复杂。目前，已发现的参与泛素化调控过程的嗜肺军团菌效应蛋白有很多，根据其作用方式可以划分为3类：(1) 通过发挥E3泛素连接酶活性介导宿主细胞内泛素化过程的效应蛋白；(2) 能够利用全新模式，完成独立于E1s与E2s的非经典泛素化过程的效应蛋白；(3) 在宿主细胞泛素化过程的后期发挥去泛素化酶活性的效应蛋白。本研究小组对于后2类嗜肺军团菌效应蛋白的探究做了大量工作，结合已报道的相关文章，本文将对这3种类型的嗜肺军团菌效应因子及其分子机制进行详细阐述。
1 效应因子模仿E3s对宿主泛素分子进行“劫持”在嗜肺军团菌效应因子介导的泛素化过程中，最常见的一种模式是：效应蛋白通过模仿宿主E3s的功能，“劫持”宿主泛素分子，进而完成细菌自身的泛素化过程。在真核细胞中，E3s是泛素调节系统中种类最多的一类酶，其在很大程度上决定了底物特异性[14]。根据E3s的结构组成，其可以分为单亚基E3s和多亚基E3s两大类(图 1)，单亚基亚类根据其所含结构域不同可以分为HECT (Homologous to the E6-AP C-Terminus)家族、RING (Really Interesting New Gene)家族和U-Box家族3种类型；多亚基亚类可以分为SCF (SKP1-Cullin1-F-box)、VHL-ELONGIN-CUL2/5、BTB-CUL3 (Bric a brac, Tramtrack and Broad Complex/Poxvirus-Cullin3)、DDB-CUL4 (UV-Damaged DNA-Binding Protein1-Cullin4)和APC (Anaphase Promoting Complex) 5种类型[15-16]。其中，单亚基类的U-Box型E3s和多亚基类的SCF型E3s是嗜肺军团菌效应蛋白的主要模仿对象。U-Box型E3s广泛存在于真核生物中，此类蛋白的C端都包含一个大约70个氨基酸残基的保守性U-Box结构域，该结构域是E3泛素连接酶发挥功能的关键区域[17]。SCF型E3s通常以复合体的形式存在，其由SKP1、CUL1、RBX1和F-Box这4个亚基组成，这些亚基分别发挥各自的功能，共同完成E3泛素化连接酶的活性：其中CUL1作为支架蛋白连接SKP1和RBX1，SKP1作为SCF型E3连接酶复合物的核心成分同时能够结合F-Box蛋白中的F-Box结构域[18]。在泛素化过程中，E2s-Ub通过与RBX1的RING-Finger结构域相互作用而结合在RBX1上，而需要被泛素化的底物则结合在F-Box蛋白的底物结合区，最终完成催化泛素化过程[19-20]。
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| 图 1 E3泛素连接酶种类 Figure 1 Types of E3 ubiquitin ligase |
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原核生物不具有编码SKP1、CUL1和RBX1的基因，因此，嗜肺军团菌中有些效应蛋白可以模仿F-Box蛋白的功能，与宿主细胞中的SKP1、CUL1和RBX1结合形成SCF复合体，从而发挥E3泛素连接酶作用[21]。目前，嗜肺军团菌中已鉴定出含有U-Box结构域的蛋白有2个，含有F-box结构域的蛋白有5个，此外还有具有新型结构域的E3泛素连接酶，如SdcA/SidC。这些效应蛋白研究情况如表 1所示。
| 基因 Gene |
效应蛋白 Effector |
结构特点 Structural features |
功能注释 Function |
参考文献 References |
| Lpg2455 | GobX | U-box结构域蛋白 U-box Protein |
E3泛素连接酶活性 E3 Ubiquitin-ligase enzymes |
[22] |
| Lpg2830 | LubX | U-box结构域蛋白 U-box Protein |
E3泛素连接酶活性 E3 Ubiquitin-ligase enzymes |
[23-24] |
| Lpg0171 | LegU1 | F-box结构域蛋白 F-box Protein |
E3泛素连接酶活性 E3 Ubiquitin-ligase enzymes |
[18, 25] |
| Lpg1408 | LicA | F-box结构域蛋白 F-box Protein |
具体功能尚不明确 Unknown |
[24] |
| Lpg2144 | LegAU13/AnkB | F-box结构域蛋白 F-box Protein |
E3泛素连接酶活性 E3 Ubiquitin-ligase enzymes |
[26-27] |
| Lpg2224 | PpgA | F-box结构域蛋白 F-box Protein |
具体功能尚不明确 Unknown |
- |
| Lpg2525 | - | F-box结构域蛋白 F-box Protein |
具体功能尚不明确 Unknown |
- |
| Lpg2510/Lpg2511 | SdcA/SidC | 无结构类似的蛋白 No structurally similar protein |
E3泛素连接酶活性 E3 Ubiquitin-ligase enzymes |
[28-29] |
| 注：-：该效应蛋白无具体蛋白名称或无相关文献报道 Note: -: The effector has no specific protein name or related literature report | ||||
目前嗜肺军团菌中鉴定出具有U-Box结构域的蛋白是LubX (Lpg2830)和GobX (Lpg2455)。LubX包含2个U-Box结构域，分别位于N端(U-Box1)和C端(U-Box2)，尽管这2个U-Box结构域在结构方面非常相似，但在功能方面却具有明显差异；其中，N端的U-Box1结构域为典型的E2s结合区域，能够结合UBE2D1、UBE2D2、UBE2D3、UBE2E、UBE2W及UBEL6等E2s，当其结构域中Ile39残基突变为Ala39，LubX丧失了体外泛素化活性；而C端U-Box2结构域中相应位点氨基酸Ile134发生突变并没有影响LubX的E3s活性，这一现象表明LubX中只有U-Box1结构域参与了与E2s的相互作用；LubX与UBE2D2复合物结构进一步证实了U-Box1与U-Box2之间的功能差异性：U-Box1中与UBE2D2相互作用所涉及的18个残基在U-Box2对应位点中有15个发生了变化，因此C端U-Box2结构域并不能发挥E3s活性，推测其功能与底物结合有关[23]。LubX具有多个靶点，例如嗜肺军团菌的另一个效应蛋白SidH和宿主的CLK1 (Cdc2-Like Kinase 1)蛋白激酶[23-24]。目前，SidH在军团菌感染过程中的功能未知，但在酵母系统中，SidH的表达明显导致了细胞生长停滞现象，与LubX共表达后，这一现象又有所缓解，因此LubX可能对SidH进行泛素化修饰，并抑制其功能的发挥[23]。CLK1蛋白激酶是LubX的另一个多聚泛素化底物，LubX可以在体外条件下与CLK1结合并对其进行泛素化修饰[24]。CLK1是一种双特异性蛋白激酶，可以通过将酪氨酸和丝/苏氨酸残基底物蛋白磷酸化来调控细胞内信号传导[30]。尽管CLK1在细胞信号传导中有着重要作用，但是目前LubX多聚泛素化CLK1蛋白激酶的生物学意义还不明确。
GobX可以利用宿主细胞催化2种不同的翻译后修饰，分别为泛素化修饰和s-棕榈酰化修饰；GobX蛋白的核心区具有典型的U-Box结构域特征，而且在与E2泛素结合酶UBE2D1、UBE2D2、UBE2D3及UBE2E1的反应中显示出E3泛素连接酶活性；其C端区域具有s-棕榈酰化活性，催化疏水性棕榈酸酯共价结合到GobX的Cys175残基上，这种修饰使得GobX能够特异性定位于高尔基体[22]。GobX具有2种翻译后修饰机制的这一特点显示出嗜肺军团菌中一种效应蛋白可能发挥出多种不同功能，从而更有利于嗜肺军团菌在宿主细胞中生长增殖。但目前，GobX的泛素化和s -棕榈酰化2种作用机制之间有何联系以及GobX的泛素化底物有待进一步研究。
1.2 含F-Box结构域的效应因子嗜肺军团菌中鉴定出含有F-Box结构域的蛋白有5种，它们是LegU1 (Lpg0171)、AnkB (Lpg2144)、LicA (Lpg1408)、PpgA (Lpg2224)和Lpg2525[18]。其中，LegU1、AnkB和LicA能够与哺乳动物细胞中SKP1相互作用，但只有前两者能够形成完整SCF复合体并发挥E3泛素连接酶活性，LicA虽能与SKP1结合，却不能进一步与CUL1蛋白结合形成SCF复合体而发挥E3泛素连接酶活性(图 2)[18]。PpgA和Lpg2525不能与SKP1相互作用，因此推测这2种效应蛋白可能不是典型的F-Box蛋白[6, 18]。
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| 图 2 含F-box结构域蛋白结构特征[18] Figure 2 Structural features of proteins with F-box domain[18] 注：A：典型F-box蛋白结构特征；B：LegU1在宿主细胞中参与泛素化调节的作用机制；C：AnkB参与宿主细胞中泛素化调节，但其作用底物尚不明确；D：LicA只与SKP1结合，不能与CUL1相互作用而进一步形成SCF型E3s复合体 Note: A: Typical F-box protein structure characteristics; B: The mechanism by which LegU1 participates in the regulation of ubiquitination in host cells; C: AnkB is involved in the regulation of ubiquitination in host cells, but its substrate is not clear; D: LicA only binds to SKP1 and cannot interact with CUL1 to form the SCF complex |
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LegU1的三维结构及具体功能目前尚不清楚，已有的研究表明LegU1能够结合宿主蛋白BAT3 (HLAB-Associated Transcript-3)，并特异性地催化其泛素化[18]。BAT3是高等真核生物中含量丰富且高度保守的蛋白，参与调控细胞凋亡、内质网应激反应等重要过程[31]。LegU1还能以BAT3-LegU1复合物的形式与另一效应蛋白Lpg2160相互作用，猜测嗜肺军团菌可能通过效应蛋白LegU1和Lpg2160干扰BAT3活性，进一步调控一些重要的细胞过程[18, 25]。
AnkB的结构由2部分组成，分别为F-Box结构域和Ankyrin结构域。F-Box结构域采用这类蛋白三α螺旋的典型的折叠方式，且包含了Leu9和Pro10等F-Box蛋白的保守性残基[26]。当AnkB与SKP1蛋白结合时，F-Box结构域嵌入SKP1蛋白表面由3个α螺旋组成的凹槽中，进而与宿主细胞中的其他SCF成分组建成一个完整的SCF复合体，发挥E3s活性；但当Leu9和Pro10这些氨基酸发生突变时，突变体AnkB无法与宿主SKP1蛋白结合[26]。Ankyrin结构域由3个锚蛋白重复序列(Ankyrin Repeats，ANK)组成，短的锚蛋白重复序列夹在2个较长的锚蛋白重复序列中间，每个锚蛋白重复序列都采用螺旋-转角-螺旋的方式折叠[26]。ANK基序普遍存在于生物体中，其主要功能是介导蛋白与蛋白之间的互作，因此，该结构域在AnkB中发挥特异性识别并结合底物的功能[26, 32]。AnkB可以通过K48型多聚泛素化链的方式将宿主细胞中的泛素分子定向到LCV和底物蛋白上，或在宿主细胞被感染的情况下，通过泛素化宿主蛋白使其被蛋白酶体降解为游离氨基酸，为嗜肺军团菌感染增殖提供碳、氮和能量，从而促进细菌在宿主胞内的增殖[26-27]。
1.3 具有新型结构域的E3泛素连接酶SidC/SdcASidC及其同源蛋白SdcA利用其自身独特的结构特点，实现由一种效应蛋白调控2个独立的细胞途径——泛素化途径和磷酸肌醇途径的过程。SidC/SdcA的结构信息显示其由4个结构域组成，分别为SNL结构域(SidC N-Terminal Ubiquitin Ligase Domain)、P4C结构域[PI(4)P Binding of SidC Domain]、INS结构域和功能未知的CTD结构域，这4个结构域紧密连接形成一个拱形结构(图 3A，3B)；SNL结构域是发挥E3泛素连接酶功能的区域，其具有保守的C-H-D催化三联体活性中心(Cys46-His444-Asp446)，三联体中的天冬氨酸和组氨酸残基可以辅助泛素分子从E2s转移至SidC，并且有利于SidC与宿主自身泛素连接酶竞争性结合E2s-Ub复合物；P4C结构域由4个相互反向的α螺旋构成，是磷脂酰肌醇-4-磷酸[PI(4)P]的结合区域，SidC/SdcA通过P4C结构域与PI(4)P结合而被定位到LCV上；SidC/SdcA结构显示，P4C结构域覆盖了SNL结构域中的泛素化连接酶催化位点(图 3C、3D)，这一独特结构特征可能是SidC蛋白分子内部进行调控的机制，P4C结构域可能是控制SNL结构域发挥E3s活性的开关：在P4C结构域结合LCV上的PI(4)P之前，SNL结构域中的酶活位点被P4C结构域覆盖，SidC/SdcA发挥较低的E3泛素连接酶活性，当P4C结构域结合PI(4)P后，覆盖区域被打开，酶活位点暴露出来，SidC/ SdcA可以发挥较高的E3s活性；INS结构域可能介导了SidC/SdcA对E2s的选择，虽然SdcA与SidC有72%的序列相似性，但二者对于E2s的亲和力有明显差别，SidC与E2酶UbcH7具有较强的亲和力，而SdcA更倾向于与E2酶UbcH5结合[28]。当SidC/SdcA的催化活性中心Cys46位点被突变为Ala46，SidC/SdcA失去了募集内质网蛋白和泛素分子至LCV的能力，因此SidC/SdcA的E3泛素连接酶活性对于内质网蛋白和泛素分子募集到LCV起着重要作用[28-29]。今后鉴定SidC/SdcA泛素化底物的研究将阐明SidC/SdcA的E3泛素连接酶活性对于嗜肺军团菌在宿主细胞内复制的意义。
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| 图 3 嗜肺军团菌效应蛋白SidC结构特征 Figure 3 Structural characteristics of Legionella pneumophila effector SidC 注：A、B：SidC包含的4个结构域：SNL结构域、P4C结构域、INS结构域和CTD结构域紧密连接形成一个拱形；C、D：SidC的P4C结构域覆盖了SNL结构域中的泛素化连接酶催化位点(D446-H444-C46) Note: A, B: SidC contains four domains: SNL domain, P4C domain, INS domain and CTD domain, they are tightly connected to form an arch; C, D: The P4C domain of SidC covers the catalytic site of the ubiquitinated ligase which in the SNL domain (D446-H444-C46) |
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随着嗜肺军团菌效应因子的生物学结构和功能的不断探究，近年来科学家们发现了由嗜肺军团菌效应因子MavC/MvcA和SidE家族蛋白调控的非常规泛素化途径。这2种新型泛素化途径与经典泛素化途径的不同点在于，它们是不依赖于三级酶联反应而进行的泛素化修饰过程(图 4)，这些新调控机制的发现有助于人们更深入地了解病原菌的侵染机制。
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| 图 4 3种不同方式的泛素化途径 Figure 4 Three different ways of ubiquitination pathways 注：A：由E1s、E2s、E3s调控的经典泛素化过程；B：MavC通过转谷氨酰胺酶活性催化Ub的谷氨酰胺残基(Q40)与E2泛素结合酶(UBE2N)的赖氨酸残基(K92)之间形成异肽键；C：以SdeA为代表的SidE家族蛋白对底物进行磷酸核糖泛素化修饰 Note: A: The classic ubiquitination process regulated by E1s, E2s, and E3s; B: MavC catalyzes the formation of isopeptide bonds between the glutamine residue (Q40) of Ub and the lysine residue (K92) of E2 ubiquitin conjugase (UBE2N) through transglutaminase activity; C: SidE family proteins represented by SdeA undergo phosphoribose ubiquitination modification on the substrate |
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嗜肺军团菌的效应因子MavC (Lpg2147)通过转谷氨酰胺酶活性将Ub的谷氨酰胺残基(Q40)与E2泛素结合酶(UBE2N)的赖氨酸残基(K92和K94)催化形成异肽键，并完成对宿主UBE2N的非典型泛素化过程[33]。这一“劫持”过程阻止了UBE2N参与宿主细胞蛋白形成K63型多聚泛素化链，从而抑制NF-kB信号通路的激活[34]。此外，我们发现嗜肺军团菌的另一效应因子MvcA (Lpg2148)可以特异性逆转由MavC催化的泛素化过程，从而在感染期间对宿主信号进行精确的时空调控[34]。
MavC与MvcA的一级序列相似性超过50%，结构也十分相似，它们都由一个插入域(Insertion Domain，INS)、一个球状中心结构域(Core Globular Domain，CG)及一个尾部α螺旋延伸区域(Tail Domain)组成，整体呈现一个弯月形(图 5A、5B)[34-35]。MavC与MvcA的结构对于其功能有着至关重要的影响，它们的3个结构域相互配合，共同完成催化过程；MavC/MvcA的INS参与对UBE2N的特异性识别，但是二者由于局部关键氨基酸及其结构的差异导致对UBE2N的亲和力具有明显差别，MavC与UBE2N有较高的亲和力并直接识别UBE2N[34-35]。在MavC催化UBE2N泛素化的过程中，Tail结构域表面所带的负电荷与Ub表面所带的正电荷相互吸引，使MavC与Ub可以稳定结合；与Ub结合后的Tail结构域发生逆时针旋转，使Ub在空间上可以更靠近UBE2N和酶活中心；INS结构域识别并结合UBE2N后也会发生逆时针旋转，同样使其在空间上可以更靠近Ub和酶活中心[35]。最终在其CG结构域中的Cys-His-Gln催化三联体的作用下，发生转谷氨酰胺反应，使Ub与UBE2N之间由异肽键连接(图 5A)；但在MvcA对由MavC催化的泛素化途径进行逆转的过程中，MvcA识别底物UBE2N-Ub，并在其CG结构域中Cys-His-Gln催化三联体的脱氨酶作用下，催化打开UBE2N-Ub之间的异肽键，MvcA与UBE2N亲和力较低，带正电荷的Tail结构域又对Ub具有排斥作用，促使了Ub和UBE2N从MvcA上分离，最终完成去泛素化过程(图 5B)[34-35]。MavC与MvcA结构高度相似，二者RMSD为0.613Å ，却发挥相反活性。基于结构的序列比对显示，二者关键区域中个别氨基酸不同，比如：MavC中的Try255位点对应MvcA中为Phe268。通过对这2个位点的氨基酸进行逆向突变，发现MavC W255F突变体及MvcA F268W突变体相对于其WT型蛋白，酶活都发生了部分逆转，这一现象证明这2个位点的氨基酸对于2个效应蛋白所发挥的活性具有至关重要的影响[35]。
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| 图 5 效应因子MavC及MvcA作用机制[35] Figure 5 The mechanism of effector MavC and MvcA[35] 注：A：MavC由INS结构域、CG结构域、Tail结构域三部分组成，INS结构域和Tail结构域分别识别并结合UBE2N与Ub。在结合UBE2N与Ub之后，INS结构域与Tail结构域都发生逆时针旋转，使UBE2N与Ub靠近CG结构域的酶活中心，MavC催化UBE2N与Ub之间的异肽连接；B：MvcA与MavC类似，也由INS结构域、CG结构域、Tail结构域三部分组成。位于CG结构域的催化中心与UBE2N-Ub结合后发挥脱氨酶活性，INS结构域与Tail结构域向相反方向旋转，打开UBE2N-Ub间的异肽键 Note: A: MavC is composed of INS domain, CG domain, and Tail domain. The INS domain and Tail domain recognize and bind UBE2N and Ub, respectively. After combining UBE2N and Ub, both the INS domain and Tail domain rotate counterclockwise, making UBE2N and Ub close to the enzymatic center of the CG domain, and MavC catalyzes the isopeptide connection between UBE2N and Ub; B: MvcA is similar to MavC, and also consists of three parts: INS domain, CG domain, and Tail domain. The catalytic center located in the CG domain binds to UBE2N-Ub and exerts deaminase activity. The INS domain and Tail domain rotate in opposite directions to open the isopeptide bond between UBE2N-Ub |
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嗜肺军团菌中的SidE家族蛋白有4个成员：SidE、SdeA、SdeB及SdeC，它们可以对多种宿主蛋白进行非典型的泛素化修饰[36]。该家族蛋白结构包含4个结构域，从N端到C端分别为DUB结构域(Deubiquitinase Domain)、PDE结构域(Phosphodiesterase Domain)、mART结构域(mono-ADP-Ribosyltransferase Domain)及CTD结构域(C-Terminal Domain)[37]。以SdeA为代表的SidE家族蛋白参与的催化过程分为两步，分别由mART结构域和PDE结构域进行催化：首先，泛素分子Arg42先在mART结构域的催化下进行ADP糖基化修饰，形成ADP糖基化泛素(ADP-Ribosylated Ubiquitin，ADPR-Ub)；随后，由PDE结构域切割ADPR-Ub中的焦磷酸键生成磷酸核糖泛素(Phospho-Ribosylated Ubiquitin，PR-Ub)，并同时将PR-Ub共价连接到底物或SdeA自身的丝氨酸残基上(图 6A)[38-39]。目前尚不清楚的是，mART结构域中形成的ADPR-Ub是如何传递到PDE结构域中进行下一步反应的。推测可能是2个或多个SidE家族蛋白在体内彼此接近，一个蛋白中mART结构域产生的ADPR-Ub被相邻蛋白中PDE结构域使用[37]。SidE家族蛋白可以PR泛素化多种宿主蛋白，进而调控多种细胞功能[40]。PR泛素化底物包括FAM134家族蛋白、TEX264和RTN3蛋白等内质网调节蛋白，这些蛋白能将内质网分解成片段，然后将内质网片段传递到溶酶体中，再通过内质网吞噬途径降解[41-42]。此外，负责维持内质网框架结构的蛋白Atlastins也可被SidE家族蛋白PR泛素化[43]。因此SidE家族蛋白调控的磷酸核糖泛素化途径通过PR泛素化一些重要的宿主蛋白而干扰细胞凋亡及囊泡运输等细胞过程，达到成功侵染宿主细胞的目的。
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| 图 6 SidE家族蛋白及效应蛋白SidJ分子机制[39] Figure 6 Molecular mechanism of SidE family proteins and effector SidJ[39] 注：A：泛素分子第42位精氨酸先在mART结构域的催化下被修饰成ADPR-Ub，随后，PDE结构域进一步切割ADPR-Ub中的磷酸二酯键，生成PR-Ub并同时将PR-Ub共价连接到底物的丝氨酸残基上；B：效应因子SidJ结合钙调蛋白CaM后，在AMP介导下对以SdeA为代表的SidE家族蛋白进行谷氨酸化修饰 Note: A: The arginine at position 42 of the ubiquitin molecule is first modified into ADPR-Ub under the catalysis of the mART domain. Then, the PDE domain further cleaves the phosphodiester bond in ADPR-Ub to generate PR-Ub, and simultaneously the PR-Ub is covalently linked to the serine residue of the substrate; B: After the effector SidJ binds to calmodulin CaM, the SidE family proteins represented by SdeA are glutamated under the mediation of AMP |
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在嗜肺军团菌中存在效应因子SidJ可以对SidE家族蛋白进行谷氨酸化修饰来限制该家族蛋白的活性，进而抑制磷酸核糖泛素化途径[44]。本研究小组对SidJ作用机制的研究发现SidJ的C端有一个可以结合钙调蛋白CaM的IQ基序，在结合CaM的情况下，SidJ的谷氨酰胺酶活性被激活；接着在AMP的介导下，SidJ-CaM复合物对SidE家族蛋白进行谷氨酸化修饰，被修饰的位点是位于mART结构域中的催化活性位点(图 6B)[44]。经修饰后的mART结构域失去了将Ub催化成ADPR-Ub的能力，SidE家族蛋白活性因此受到抑制[45-46]。迄今为止，只在军团菌中发现了磷酸核糖泛素化途径的存在，这种独特的翻译后修饰机制是否存在于真核细胞中还有待进一步探究[37]。随着效应因子功能研究的不断深入，或许还将发现其他的调控方式，这些新型非经典泛素化途径的发现对病原体侵染宿主的作用机制提供了新的例证。
3 嗜肺军团菌中具有去泛素酶活性的效应蛋白蛋白质的泛素化是一个可逆的过程，去泛素酶(Deubiquitinases，DUBs)蛋白家族可以通过水解泛素羧基末端的酯键、肽键或者异肽键，将泛素修饰后的蛋白去泛素化，从而将泛素分子从底物蛋白中水解释放出来，从靶蛋白上脱落的泛素分子又可以进行回收利用[47-48]。DUBs可以被细菌用来调控宿主的泛素化系统，以抑制宿主的免疫系统，并最终达到成功侵染宿主细胞的目的[49]。近年来的研究发现，嗜肺军团菌中同样包含多个具有DUBs活性的效应蛋白，这些效应蛋白包括DupA、DupB、RavD和Ceg23等。
3.1 参与调控磷酸核糖泛素化途径的去泛素化酶DupA/B在对效应因子SdeA功能研究时发现，SdeA具有一个PDE结构域，该结构域可以催化磷酸核糖泛素化底物的生成[37]。进一步研究发现，效应因子Lpg2154、Lpg2509、Lpg1496、Lpg2239及Lpg2523中都包含有PDE结构域[50]。其中Lpg2154和Lpg2509具有70%相似性，它们都能有效地从磷酸核糖泛素化底物中水解释放出PR-Ub，因此被命名为DupA (Deubiquitinase for PR-Ubiquitination)和DupB；DupA与DupB通过催化PR-Ub的磷酸基团与底物丝氨酸之间的磷酸酯键断裂，使磷酸核糖泛素化的底物释放出PR-Ub，并还原底物[51] (图 7)。DupA/B及SidJ都可以参与调控由SidE家族蛋白介导的磷酸核糖泛素化途径，其差别在于DupA/B与SidJ作用对象及结果不同，DupA/B针对磷酸核糖泛素化底物发挥去泛素酶活性[50]，SidJ则是作用于SidE家族蛋白的酶活位点，对SidE家族蛋白的功能进行抑制[44]。DupA/B与SidJ功能的发现让磷酸核糖泛素化途径趋于完整：DupA和DupB可能在感染早期就开始发挥作用，并持续在感染过程中将磷酸核糖泛素化的底物去泛素化，从而将宿主细胞中的磷酸核糖泛素化底物维持在一个可控范围内；在感染后期，再由效应蛋白SidJ对SidE家族蛋白活性进行抑制，终止磷酸核糖泛素化反应[50]。因此，磷酸核糖泛素化途径通过特异性的去泛素化酶以及SidE家族蛋白特异性抑制因子的协调作用完成精准调控。
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| 图 7 效应蛋白DupA/DupB分子机制 Figure 7 Molecular mechanism of effector DupA/DupB |
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泛素化链具有多种类型，泛素分子的7个赖氨酸位点(K6、K11、K27、K29、K33、K48和K63)及N端甲硫氨酸(Met1)位点都可以延伸形成泛素化链[52-53]。其中Met1连接的线性泛素链是由线性泛素链组装复合物(Linear Ub Chain Assembly Complex，LUBAC)合成的，其连接形式是以肽键头尾串联的方式连接的[53]。线性泛素链在细胞生命中具有重要作用，当病原体侵入宿主细胞中，巨噬细胞能识别并“标记”出病原体，对其进行线性泛素化修饰，从而激活宿主NF-κB免疫信号通路[53-54]。嗜肺军团菌的效应蛋白RavD对线性泛素链具有特异性去泛素化酶活性，其C端结构域能够结合磷脂酰肌醇-3-磷酸[PI(3)P]和磷脂酰肌醇-4-磷酸[PI(4)P]从而使RavD定位于LCV上，其去泛素化酶结构域位于N端，该结构域的折叠类似于木瓜蛋白酶，具有Cys-His-Ser催化三联体基序，能够持续性地水解泛素分子Met1与Gly76之间的肽键，避免LCV上线性泛素链的累积，达到抑制宿主NF-κB免疫信号的目的[55]。在军团菌属细菌中，RavD的同源蛋白也具有切割线性泛素链的去泛素化酶活性，表明切割线性泛素链是军团菌属细菌在宿主细胞内生存的一个普遍机制[55]。由于RavD与真核细胞中的去泛素化酶完全不同，RavD成为研究线性泛素链的全新工具，为真核细胞信号转导的研究提供了新的思路。
3.3 作用于多聚泛素化链的去泛素化酶Ceg23军团菌效应蛋白Ceg23属于OTU家族去泛素化酶，其对K63型多聚泛素化链显示出较高的催化特异性，能够从K63型多聚泛素化修饰的蛋白质中去除泛素分子，从而对宿主细胞中的泛素化途径进行调控；Ceg23具有439个氨基酸残基，我们研究小组对Ceg23的晶体结构进行解析，揭示其包含一个经典的OTU结构域并具有一个保守疏水性螺旋臂(Helical Arm)和S1结合位点(S1 Site)；但与其他OTU家族蛋白不同的是，Ceg23具有一个独特的插入域(Insertion Domain，INS)，S1结合位点存在于该插入域中[56]。在OTU家族蛋白中，S1结合位点是泛素分子的结合区域，实验表明Ceg23中的INS结构域可能是Ceg23识别并结合泛素分子的关键所在[49, 56]。目前尚未有Ceg23与Ub复合物的晶体结构报道，但是二者的分子对接结果表明，泛素分子的C末端与Ceg23的C29位点之间可能形成共价连接，同时Ceg23螺旋臂中的疏水性M144和L149参与了对泛素分子的识别[56]。另外，根据预测，Ceg23羧基末端包含了2个跨膜结构域，该结构域能够将其定位在内质网上[56]。内质网在军团菌感染过程中起重要作用，其是形成LCV膜的主要来源[57-58]，因此Ceg23可能用于调节LCV上的K63型多聚泛素化[56]。
4 总结与展望泛素化修饰调控着真核细胞中一些重要的生命活动[59-60]，如K48型泛素化连接能够启动蛋白酶体的降解反应[61]；K63型泛素化连接能够活化部分蛋白进行信号传递[61-62]。与此相对应，细胞内还有一系列的去泛素化酶可以用于调控信号的开闭等[4]。在与宿主的长期“博弈”过程中，病原菌进化出多种方式来干预宿主的泛素化修饰系统，从而达到增强感染效率和逃避免疫“监视”的目的。近年来报道的嗜肺军团菌效应因子的相关研究为我们深入探索病原菌调控泛素化系统的机制提供了帮助。嗜肺军团菌中GobX、LubX、LegU1、AnkB及SidC等效应因子通过E3泛素连接酶功能对宿主细胞中的泛素系统进行“劫持”[22-29]。其中GobX及LubX含有经典的U-box结构域，从而发挥典型U-box E3s功能[22-24]；LegU1及AnkB含有F-box结构域且能够与宿主中的SKP1、CLU1及RBX1蛋白结合，构成完整的SCF复合体型E3s[25-27]；SidC则是通过其N端新型的SNL结构域结合泛素分子形成SidC-Ub中间体，继而发挥E3泛素连接酶活性，将泛素分子转移至底物[28-29]。在对嗜肺军团菌效应因子功能探究的过程中，科学家们还发现了可调控非经典泛素化途径的效应因子：MavC及SidE家族蛋白[33-39]。MavC通过转氨酶活性将Ub以异肽键的方式连接在UBE2N的K92及K94位残基上，进而抑制免疫信号的激活[34-35]；SidE家族蛋白无需利用宿主细胞中的E1s、E2s及ATP，仅利用NAD+作为辅助因子对宿主细胞中多种重要蛋白进行磷酸核糖泛素化修饰，进而调控宿主内多种重要的细胞过程[36-39]。虽然各个效应因子的分子机制存在差异，但一个显著的特点是，效应因子之间能够相互调控。例如效应因子LubX能够靶向军团菌中另一个效应因子SidH，在感染后期对SidH进行时间上的精准调控[23]。MavC的同源蛋白MvcA能针对MavC介导的非经典泛素化过程进行逆转，在感染后期维持宿主细胞正常生理活动[34-35]。效应蛋白SidJ通过谷氨酸化修饰SidE家族蛋白的活性位点从而抑制SidE家族蛋白的功能[44]，DupA/B蛋白能特异性去泛素化由SidE家族蛋白催化形成的PR-泛素化底物[50-51]。此外，还有一些效应蛋白在宿主细胞中发挥去泛素化酶功能。如RavD能特异性识别并切割线性泛素化链[55]；Ceg23结构类似于OTU家族蛋白，对K63型多聚泛素化链具有去泛素化酶活性[56]。尽管嗜肺军团菌效应因子的功能及分子机制的研究近几年取得突破性进展，但很多问题还亟待解决。例如，一些与泛素化调节相关的效应因子具体的分子作用机制有待进一步解析，除已发现的MavC及SidE家族蛋白以外是否还存在其他效应因子可调控不同方式的非经典泛素化途径，以及嗜肺军团菌庞大效应库中的其他重要效应因子所发挥的功能及作用机理等都将成为我们进一步研究的课题。
近年来关于病原菌调控宿主泛素化系统的报道相继出现，例如，肠出血性大肠杆菌(EHEC)毒力蛋白NleL能够结合宿主JNK蛋白并对其特定位点(K68)进行泛素化修饰，从而通过抑制宿主JNK/AP-1通路来促进EHEC粘附宿主并形成A/E损伤[63]；结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis，Mtb)的效应蛋白PtpA及RV0222可以利用宿主中的泛素分子抑制宿主自身免疫信号通路的激活[64]。这些例证表明各种病原菌效应蛋白利用人体泛素化系统抵御人体免疫攻击的机制普遍存在。因此，对这些效应因子的深入研究有利于了解许多病原体致病过程，而且对于开展针对性治疗有着重要的意义。嗜肺军团菌作为研究胞内致病菌致病机制的理想模型，对其效应因子作用机制的不断探究能为更多病原菌的治疗提供新的药物靶点。
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