2021, Vol. 48
表1(Table 1)
霍乱弧菌Ⅵ型分泌系统的效应蛋白对细菌细胞壁的降解机制
扩展功能
文章信息
- 王增航, 董涛
- WANG Zenghang, DONG Tao
- 霍乱弧菌Ⅵ型分泌系统的效应蛋白对细菌细胞壁的降解机制
- Bacterial cell wall degradation by type Ⅵ secretion system effector proteins in Vibrio cholerae
- 微生物学通报, 2021, 48(1): 135-144
- Microbiology China, 2021, 48(1): 135-144
- DOI: 10.13344/j.microbiol.china.200512
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文章历史
- 收稿日期: 2020-05-26
- 接受日期: 2020-07-07
- 网络首发日期: 2020-07-29
王增航, 董涛. 霍乱弧菌Ⅵ型分泌系统的效应蛋白对细菌细胞壁的降解机制[J]. 微生物学通报, 2021, 48(1): 135-144.
WANG Zenghang, DONG Tao. Bacterial cell wall degradation by type Ⅵ secretion system effector proteins in Vibrio cholerae[J]. Microbiology China, 2021, 48(1): 135-144.
霍乱弧菌Ⅵ型分泌系统的效应蛋白对细菌细胞壁的降解机制
上海交通大学生命科学技术学院 上海 200240
摘要: 【背景】 肽聚糖(Peptidoglycan，PG)是细菌细胞壁的重要组成部分，而霍乱弧菌Ⅵ型分泌系统(Type Ⅵ Secretion System，T6SS)可以分泌具有肽聚糖水解酶活性的效应蛋白到受体细菌中杀死细胞，这类水解酶的作用机制尚未研究清楚。【目的】 通过对细菌细胞壁的PG成分进行研究，建立细胞壁PG成分分析方法，并对霍乱弧菌T6SS分泌的2个破坏细胞壁的效应蛋白TseH和VgrG3的作用机制进行解析。【方法】 使用显微镜观察TseH和VgrG3异位表达对宿主细菌生长的影响；纯化大肠杆菌细胞壁，使用透射电子显微镜(Transmission Electron Microscope，TEM)观察提纯的细胞壁形态；使用纯化的TseH和VgrG3分解消化PG，利用超高效液相色谱-飞行时间质谱(Ultra-Performance Liquid Chromatography-Time-of-Flight Mass Spectrometry，UPLC-TOFMS)分析鉴定消化后的产物成分；通过分析结果推导结构。【结果】 通过透射电子显微镜观察，发现提纯的PG呈现半透明的薄膜泡状；通过UPLC-TOFMS的分析以及逆向推导，得到了提纯的PG被VgrG3水解酶降解之后的3种主要产物，分别是二糖二肽(Disaccharide，Di)、二糖三肽(Disaccharide Tripeptide，Tri)和二糖四肽(Disaccharide Tetrapeptide，Tetra)。【结论】 建立了提纯PG和UPLC-TOFMS分析PG成分的方法，揭示了效应蛋白VgrG3而非TseH可以降解PG多糖链N-乙酰葡糖胺和N-乙酰胞壁酸之间的β(1-4)糖苷键的功能。由于攻击细胞壁的效应蛋白在革兰氏阴性细菌中广泛存在，本研究不仅为鉴定这类重要效应蛋白的功能提供了有效的方法，而且对研究靶向细胞壁的新型抗生素也有重要的指导作用。
关键词:
细菌细胞壁 肽聚糖 Ⅵ型分泌系统(T6SS) TseH VgrG3
Bacterial cell wall degradation by type Ⅵ secretion system effector proteins in Vibrio cholerae
School of Life Sciences and Biotechnology, Shanghai Jiao Tong University, Shanghai 200240, China
Abstract: [Background] Peptidoglycan (PG) is an important component of the bacterial cell wall. The type Ⅵ secretion system (T6SS) can secrete effectors with peptidoglycan hydrolase activities into a neighbor bacterial cell to kill the recipient. However, the enzymatic functions of these effectors have not been fully characterized due to the technical challenges in PG analysis. [Objective] We aim to establish an analytical method using liquid chromatography and mass spectrometry to qualitatively determine the PG-hydrolyzing activities of two Vibrio cholerae effectors TseH and VgrG3. [Methods] The antibacterial effects of TseH and VgrG3 were determined by survival assays and microscopy analysis when ectopically expressed in Escherichia coli. Peptidoglycan was purified from E. coli, and morphologically characterized by transmission electron microscopy (TEM). The ultra-performance liquid chromatography-time-of-flight mass spectrometry (UPLC-TOFMS) was used to identify the products of peptidoglycan from digestion by TseH or VgrG3. [Results] TEM micrograph showed that the purified peptidoglycan is translucent. Using UPLC-TOFMS to analyze VgrG3-treated PG, we identified three products including disaccharide dipeptide (Di), disaccharide tripeptide (Tri), and disaccharide tetrapeptide (Tetra). [Conclusion] VgrG3, rather than TseH, can digest the β(1-4) covalent bond between N-acetylglucosamine and N-acetylmuramic acid. The established method could facilitate the characterization of other cell-wall targeting antibacterial effectors and chemical compounds.
Keywords:
bacterial cell wall peptidoglycan type Ⅵ secretion system (T6SS) TseH VgrG3
细菌细胞壁对于细菌的形态维持有着重要的支持作用，同时，其可以作为基质锚定一些蛋白质和脂多糖，从而行使一些重要的生物学功能[1]。肽聚糖(Peptidoglycan，PG)是大多数细菌细胞壁中都存在的重要结构成分[1]。PG的一般化学结构在所有细菌种类中都相同，并且由多糖链形成的聚糖骨架组成，该多糖链由通过β(1-4)糖苷键连接的N-乙酰葡糖胺和N-乙酰胞壁酸的重复二糖单元组成[2-3]。二糖单元与短肽连接，聚合并交联以形成包裹细胞的连续网络结构[3-4]。在大肠杆菌和其他大多数革兰氏阴性细菌中，该短肽的氨基酸顺序为l-Ala-d-Glu-m-Dap-d-Ala-d-Ala (m-Dap，meso-Diaminopimelic acid)，其中相邻的两条多糖链可以通过短肽第3位m-Dap的ε-氨基与另一条短肽第4位d-Ala的羧基交联[2, 5]，从而形成交织的网状结构。
细胞壁在维持细菌细胞形态的同时，还起到抵抗细菌内部渗透压以及抵御外源裂解酶侵害的作用[6-7]。由于细胞壁对细菌的生长和存活至关重要，因此是抗生素的主要作用靶标[8]。例如，青霉素和其他β-内酰胺类(如碳青霉烯类和头孢菌素类)抗生素就是通过抑制细菌复制期间PG的合成来发挥抗菌作用[9]。因此，研究细胞壁成分对理解抗生素分子的作用机制十分重要。
在革兰氏阴性细菌中，跨越细菌包膜的蛋白质运输具有很大的挑战性，因为蛋白质必须穿过至少3个屏障：外膜、PG层和内膜[10]。近年来，国内外对Ⅵ型分泌系统(Type Ⅵ Secretion System，T6SS)的研究发现，T6SS可以跨过细胞壁将其Hcp (Haemolysin Co-Regulated Protein)内管、由VgrG (Valine-Glycine Repeat Protein G)和PAAR (Proline-Alanine-Alanine-Arginine)蛋白组成的尖端复合物以及毒性效应蛋白注射到临近的细胞中[11-15]。因此，T6SS作为一种细菌武器，能够穿透受体细菌的细胞膜和细胞壁将毒性效应蛋白注射到相邻的细胞中[12-13, 16]。该分泌系统可以通过分泌具有肽聚糖水解酶活性的效应蛋白到相邻细菌中，从而引起相邻细菌细胞壁的降解，导致细菌死亡[7, 17-18]。通过T6SS分泌的毒性效应蛋白都有其对应的免疫蛋白的存在，后者通过蛋白间直接结合中和效应蛋白的毒性来防止受到同种细菌伤害[14, 18-19]。除此之外，细菌为了防御T6SS的攻击，还有其他非特异性的防御手段，例如霍乱弧菌(Vibrio cholerae)可以通过产生可分泌的胞外多糖，在供体和受体之间建立屏障，以限制T6SS的杀伤和修复细菌的应激反应系统对效应蛋白造成的损伤[20-22]。另外，革兰氏阳性细菌中的PG层可作为物理屏障来防御革兰氏阴性竞争对手的T6SS攻击[20]。铜绿假单胞菌(Pseudomonas eruginosa)还可以通过感知来源于外界的T6SS的攻击，进而利用自身T6SS对其进行反击[23]。
近年来，针对靶向PG的水解酶作用位点和分泌途径的研究在国内外有着相当高的热度。例如在铜绿假单胞菌中，已经鉴定出多种具有肽聚糖水解酶活性的T6SS效应蛋白，其中Tse1和Tse3分别具有肽聚糖酰胺酶和肽聚糖水解酶活性[7]。Tse1作用于PG上短肽第2位d-Glu和第3位m-Dap之间的酰胺键，而Tse3作用于PG多糖链上的β(1-4)糖苷键，并且两者都可以通过T6SS进入到受体细菌中导致其死亡[7, 24]。AmpDh3是铜绿假单胞菌中的一种周质锌蛋白，与细胞壁重塑密切相关[25]。AmpDh3通过H2-T6SS进入受体细胞，其在PG上的作用位点不同于Tse1以及Tse3，而是PG的双糖单位与短肽之间的酰胺键[26]。最近的报道中，霍乱弧菌T6SS的分泌蛋白TseH也是靶向受体细菌细胞壁的毒性蛋白，当其在宿主细菌周质空间表达时显示出对宿主的毒性，但其具体作用位点尚未完全明确[27-29]。霍乱弧菌中另一T6SS效应蛋白VgrG3是具有肽聚糖结合区域的T6SS结构蛋白，可以降解革兰氏阴性菌细胞壁[18, 30]。本研究建立在对PG成分分析的基础上，对这2种毒性效应蛋白TseH和VgrG3进行研究，旨在分析这2种蛋白的具体作用位点，并建立PG成分分析的方法，以期为后续研究细菌PG的损伤和损伤后的修复机制奠定基础。
1 材料与方法 1.1 菌株、质粒及培养方法实验所使用的菌株以及质粒如表 1所示。细菌于37 ℃环境培养；所用LB培养基(g/L)：胰蛋白胨10.0，酵母粉5.0，氯化钠5.0，琼脂13.0 (固体培养基)。培养基于1×105 Pa灭菌30 min之后使用，若无特殊说明，卡那霉素的使用浓度均为50 μg/mL。
表 1 实验所用菌株以及质粒
Table 1 Strains and plasmids used in this study
| 菌株和质粒 Strains and plasmids |
描述 Description |
来源 Sources |
| Strains | ||
| Escherichia coli T-Fast | Used for plasmids construction | Lab stock |
| Escherichia coli BL21(DE3) | Used for proteins purification and toxicity verification in vivo | Lab stock |
| Escherichia coli MG1655 | Used for peptidoglycan purification | Lab stock |
| Plasmids | ||
| pETSUMO-TseH | Used for TseH expression with a N-terminal 6×His epitope tag in SUMO-tag | T his study |
| pET-28a-VgrG3 | Used for VgrG3 expression with a N-terminal 6×His epitope tag | This study |
| pETSUMO-VgrG3C | Used for VgrG3C expression with a N-terminal 6×His epitope tag in SUMO-tag | This study |
| pSF1877-scUlp1 | Used for SUMO-specific protease Ulp1 (scUlp1) purification | [31] |
蛋白纯化所用磷酸缓冲液为：Buffer 0：磷酸氢二钠50 mmol/L，氯化钠300 mmol/L，pH 8.0；Buffer 1：磷酸氢二钠50 mmol/L，氯化钠300 mmol/L，咪唑10 mmol/L，pH 8.0；Buffer 2：磷酸氢二钠50 mmol/L，氯化钠300 mmol/L，咪唑40 mmol/L，pH 8.0；Buffer 3：磷酸氢二钠50 mmol/L，氯化钠300 mmol/L，咪唑100 mmol/L，pH 8.0；Buffer 4：磷酸氢二钠50 mmol/L，氯化钠300 mmol/L，咪唑250 mmol/L，pH 8.0；Buffer 5：磷酸氢二钠50 mmol/L，氯化钠300 mmol/L，咪唑400 mmol/L，pH 8.0。
TransStart® TopTaq酶，北京全式金生物技术有限公司；Gibson组装试剂盒，NEB公司；溶菌酶(Lysozyme)，生工生物工程(上海)股份有限公司。显微镜，尼康公司；生物型透射电镜，Thermo Fisher Scientific公司；超高效液相色谱-飞行时间质谱，Agilent Technologies公司。
1.3 E. coli MG1655细胞壁肽聚糖分离PG的分离方法参照文献[32]。将E. coli MG1655接种到10 mL新鲜液体LB中，然后37 ℃、200 r/min培养8 h。取2 mL菌液将其接种于2 L新鲜LB中，在37 ℃下培养8 h，4 ℃、3 000×g离心30 min收集细胞。用超纯水洗涤细胞一次，然后将沉淀重悬至OD600为70，在缓慢搅拌条件下逐滴加入至等体积沸腾的8% SDS溶液中，过程中保持混合物沸腾状态。将混合物缓慢搅拌并继续煮沸3 h，然后室温冷却，于20 ℃、100 000×g离心1 h收集粗产物PG沉淀。用无菌超纯水洗涤4次以上除去SDS，每次20 ℃、100 000×g离心1 h收集沉淀。将最终产物重悬于10 mL pH 7.0的10 mmol/L Tris-HCl中，并加入5 mg DNase I和16 mg胰蛋白酶，然后在37 ℃下孵育16 h。混合物于室温、100 000×g离心1 h之后，用20 mL无菌超纯水将沉淀重悬，再次用等体积的8% SDS溶液煮沸并再次去除SDS。终产物PG用无菌超纯水重悬至终浓度20 mg/mL。
1.4 肽聚糖水解酶纯化vgrG3和vgrG3C基因以铜绿假单胞菌基因组DNA为模板，通过PCR进行扩增；pET-28a和pETSUMO载体片段分别以pET-28a和pETSUMO质粒为模板，通过PCR进行扩增。引物由北京擎科新业生物技术有限公司合成(表 2)。PCR反应体系(50 μL)：ddH2O 37 μL，上、下游引物(10 μmol/L)各1 μL，细菌基因组DNA 1 μL或者质粒DNA (1 mmol/L) 1 μL，TransStart® TopTaq酶(2.5 U/μL) 1 μL，dNTPs (2.5 mmol/L) 4 μL，10×TransStart® TopTaq Buffer 5 μL。PCR反应条件：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 3 min，35个循环；72 ℃ 3 min；12 ℃保存。PCR扩增片段通过Gibson组装的方式连接到pET-28a或者pETSUMO载体质粒上，然后导入到E. coli T-Fast和BL21(DE3)感受态细胞中用于验证、扩增和下一步的实验。
表 2 实验所用引物
Table 2 Primers used in the experiment
| 引物名称 Primers name |
序列 Sequence (5ʹ→3ʹ) |
| pET28a-VgrG3-hifi-F | AGCAAATGGGTCGCGGATCCATGGCAAGGTTACAGTTTCAATTAAAGGTG |
| pET28a-VgrG3-hifi-R | TTGTCGACGGAGCTCGAATTCCATTTTATATCAACCTCCAAACCGTCAATTTC |
| pET28a-hifi-F | TGGAATTCGAGCTCCGTCGACAA |
| pET28a-hifi-R | GGATCCGCGACCCATTTGCT |
| pETSUMO-hifi-F | CTCGAGGTCGACAGACAAGCTTAGGT |
| pETSUMO-hifi-R | GGATCCACCACCAATCTGTTCTCTGTG |
| pETSUMO-VgrG3C-F | CACAGAGAACAGATTGGTGGTGGATCCCTCAAACCATCCGATGAGTTAGAGAAACTC |
| pETSUMO-VgrG3C-R | ACCTAAGCTTGTCTGTCGACCTCGAGTCATTTTATATCAACCTCCAAACCGTCAAT |
将导入重组质粒的E. coli BL21(DE3)菌株接种在含有卡那霉素的LB平板上，并在37 ℃培养箱中培养过夜。在平板上生长的细菌接种至10 mL LB中孵育3 h，然后转接至2 L新鲜LB中。在培养物OD600为0.6以上时，将IPTG加入培养物中至终浓度为1 mmol/L，并在20 ℃培养箱中诱导16 h。诱导后的细菌通过4 ℃、2 500×g离心10 min收集，重悬于20 mL Buffer 1中，使用超声破碎仪在240 W功率下破碎20 min (工作7 s，间隔5 s)。破碎产物在4 ℃环境下10 000×g离心10 min，收集上清，使用镍离子金属螯合亲和层析柱收集目的蛋白，依次使用Buffer 2、Buffer 3、Buffer 4洗涤并收集目的蛋白，最后使用Buffer 5冲洗层析柱。收集的蛋白封装于半透膜袋中，在Buffer 0中进行脱盐，最后使用超滤离心管浓缩至10 mg/mL。以上蛋白纯化步骤均在4 ℃环境下进行。
对于TseH效应蛋白的纯化，使用纯化脱盐后的scUlp1蛋白与SUMO-TseH蛋白按质量比1:50混合，并在室温下孵育30 min，使用镍离子金属螯合亲和层析柱去除带有组氨酸标签的scUlp1蛋白、SUMO-tag以及未被切除标签的SUMO-TseH蛋白，收集流出液中未带组氨酸标签的TseH蛋白。
1.5 显微镜观察肽聚糖水解酶体内毒性将导入重组质粒的E. coli BL21(DE3)菌株接种在含有卡那霉素的LB平板上，并在37 ℃培养箱中培养过夜。在平板上生长的细菌挑单菌落接种至2 mL LB中，37 ℃生长至OD600为1.0，平均分成2管，常温下2 500×g离心浓缩至OD600为5.0，分别使用含有或者不含有1 mmol/L IPTG的新鲜LB重悬，取2 μL滴在含有或者不含有1 mmol/L IPTG的琼脂糖胶层上，将其置于干净无尘的载玻片上并盖上盖玻片，使用显微镜的DIC明场观察宿主在时间轴上的变化。
1.6 细胞壁肽聚糖形态观察提取纯化的PG样品用无菌超纯水稀释至0.1 mg/mL，振荡混匀，取2 μL滴于电镜专用铜网之上，使其自然晾干。待铜网表面没有明显液体痕迹后，滴加5 μL磷钨酸进行负染，1 min后将多余染液使用无尘吸水纸吸走，然后自然风干，使用透射电子显微镜进行观察。
1.7 肽聚糖水解酶体外消化PG将提纯的PG样品添加到含0.1% Triton X-100的10 mmol/L Tris-HCl缓冲液中，使OD600为0.2。然后取100 μL PG样品4份，分别添加0.2 mg/mL GFP、溶菌酶、TseH，或者0.02 mg/mL VgrG3 (每种蛋白溶液各2.5 μL)，置于37 ℃环境中振荡孵育，每5 min在OD600处检测吸光度值。
1.8 UPLC-TOFMS分析细胞壁肽聚糖降解产物PG用乙醇洗涤2次，并用无菌超纯水洗涤4次以上去除乙醇。由于Tris缓冲液体系会干扰UPLC-TOFMS仪器的检测，因此将500 μg PG与500 μg肽聚糖水解酶在缓冲液(50 mmol/L磷酸氢二钠，300 mmol/L氯化钠，pH 8.0)中混合，并在37 ℃振荡孵育2 h。将反应产物用等体积的甲醇溶解，在室温下21 000×g离心20 min收集上清溶液。这些产物的分析参照文献[33]，通过UPLC-TOFMS在阳性模式下检测。UPLC-TOFMS分析使用ACE Eclipse C18色谱柱，梯度条件为1%缓冲液B (100%甲醇)和99%缓冲液A (超纯水，0.1%甲酸)，然后在65 min内梯度洗脱变化至20%缓冲液B，继续变化至70%缓冲液B的梯度时间为65 min，并保持此条件继续洗脱10 min，最后变化至1%缓冲液B的梯度时间为1 min。
2 结果与分析 2.1 肽聚糖水解酶体内毒性为了测定2种靶向PG的水解酶毒力水平，用IPTG诱导肽聚糖水解酶在E. coli BL21(DE3)内表达并检测其对细胞的杀伤力。为了辅助TseH的表达，在其N端连接了增强可溶性的蛋白标签SUMO (Small Ubiquitin-Related Modifier)。如图 1所示，SUMO-TseH在进行体内表达时并未显示其杀菌活性。野生型VgrG3以及其携带氨基酸序列648-708区域的C端截短突变体仍具有体内毒性[34]，因此选用该水解酶的野生型以及氨基酸序列709-1 017区域(VgrG3C)的2种蛋白进行实验。为了辅助VgrG3C蛋白的表达，在其N端连接了SUMO蛋白标签。VgrG3在被诱导表达时对宿主细菌具有毒性，而SUMO-VgrG3C具有比全长VgrG3蛋白稍弱的毒性(图 1)。显微镜下观察体内表达情况时，发现表达VgrG3和SUMO-VgrG3C的细胞在被诱导后会破裂，未被诱导的宿主则正常生长；表达TseH的宿主在被诱导以及未被诱导情况下均能正常生长(图 2)。这些结果表明VgrG3在体内表达时能够表现出杀菌活性，并且在C末端区域可能具有未知的跨膜功能。
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| 图 1 T6SS效应蛋白VgrG3和TseH对E. coli的毒性 Figure 1 Survival of E. coli when VgrG3 or TseH was expressed 注：转入重组质粒的E. coli BL21(DE3)在不添加诱导剂的液体LB中37 ℃、200 r/min培养至OD600为1.0，梯度稀释后取3 μL滴至含有0.1 mmol/L IPTG或者0.2%葡萄糖的新鲜LB平板上，置于37 ℃恒温培养箱中培养12 h Note: E. coli BL21(DE3) with plasmids expressing TseH, SUMO-VgrG3C or VgrG3 were grown in liquid LB at 37 ℃, 200 r/min until OD600=1.0. Survival was examined by serial dilution and plating on LB plates containing 0.1 mmol/L IPTG or 0.2% glucose, which were subsequently incubated at 37 ℃ for 12 h |
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| 图 2 体内表达VgrG3导致细菌死亡 Figure 2 Expression of VgrG3 in vivo causes bacterial death 注：使用显微镜观察转入重组质粒的E. coli BL21(DE3)的生长状态。箭头指示细菌破裂现象 Note: E. coli BL21(DE3) with plasmids expressing TseH, SUMO-VgrG3C or VgrG3 were examined by microscopy. The arrow indicates bacterial death |
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为了研究所选水解酶的体外活性，提纯了E. coli MG1655 PG进行进一步的实验。通过电子透射显微镜的观察，发现提纯的PG呈现半透明的薄膜泡状(图 3)。VgrG3和TseH的纯化结果如图 4所示。由于VgrG3体内表达时对宿主细胞具有毒性，因此纯化蛋白产量较低。因此，选用大规模培养的方式来提高VgrG3蛋白的获得量，最终在500 mL细菌培养物中纯化得到了10 mg目标蛋白。SUMO-TseH在纯化并经scUlp1蛋白酶处理去除SUMO标签后，从100 mL细菌培养物纯化得到了2 mg目标蛋白。由于肽聚糖水解酶可以将不溶的大分子PG降解成小分子的可溶片段，将提纯的PG与提纯的水解酶以及溶菌酶进行体外共孵育，并通过检测OD600的光密度值变化发现，溶菌酶和VgrG3这2种水解酶可以大幅度降低混合物的光密度值，而TseH所处理的样品并未有明显的光密度值变化(图 5)。这些结果表明，与商品化的溶菌酶类似，VgrG3可以有效地在体外降解消化提纯的PG，并且具有更高的体外活性。相反，TseH不具备体外PG降解活性。
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| 图 3 透射电子显微镜下E. coli MG1655 PG形态 Figure 3 TEM imaging of purified E. coli MG1655 peptidoglycan |
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| 图 4 两种效应蛋白TseH和VgrG3的纯化结果 Figure 4 urification results of TseH and VgrG3 注：A：TseH蛋白纯化结果；B：VgrG3蛋白纯化结果。40、100、250 mmol/L分别代表洗脱液中咪唑浓度；Purified样品代表最终的纯化蛋白；After cleavage样品代表所纯化的SUMO-TseH去掉SUMO蛋白标签之后的TseH样品。各样品上样量为10 μL Note: A: Purification of TseH; B: Purification of VgrG3. The lanes named 40, 100 and 250 mmol/L represent the concentration of imidazole used in the elution buffers. "Purified" represents the final purified protein. The lane named "After cleavage" represents the TseH protein after the removal of the SUMO tag. Each lane was loaded with 10 μL of sample |
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| 图 5 肽聚糖水解酶体外消化PG Figure 5 PG digested by peptidoglycan hydrolase in vitro 注：100 μL OD600为0.2的PG悬浮液分别添加0.2 mg/mL GFP、溶菌酶或TseH或者0.02 mg/mL VgrG3 (每种蛋白溶液各2.5 μL)，每隔5 min测定其在600 nm处的光密度值 Note: 2.5 μL of 0.2 mg/mL GFP, lysozyme, TseH or 0.02 mg/mL VgrG3 was added into 100 μL of PG suspension (OD600=0.2), respectively. And the optical density at 600 nm was measured every 5 min |
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细胞壁PG骨架主要是以交替排列的糖链与其上连接的短肽链组成。为了进一步分析几种水解酶的作用位点以及PG的构成成分，使用溶菌酶和VgrG3对分离纯化得到的薄膜泡状E. coli MG1655 PG进行体外的消化水解，并对消化水解的产物进行分析。实验中发现PG消化水解的产物中有很多不能溶解的成分，但本研究只对可溶解的产物进行了进一步的分析鉴定。因为TseH没有造成明显的细胞壁水解(图 5)，无法得到可溶解的产物进行下一步分析，因此聚焦于VgrG3对PG降解产物的分析。通过UPLC-TOFMS的分析结果鉴定出PG消化后的产物中有3种主要成分：二糖二肽(Disaccharide Dipeptide，Di)、二糖三肽(Disaccharide Tripeptide，Tri)和二糖四肽(Disaccharide Tetrapeptide，Tetra) (图 6A)。通过对MASS的检测结果分析得到这3种化合物成分所对应的分子质量，并由此推测出该3种化合物的化学结构式(图 6B-6D)。详细的数据见表 3。UPLC-TOFMS的结果表明，这3种糖肽是构成PG的重要成分。因此，我们推测效应蛋白VgrG3通过水解PG多糖链上双糖单位之间的β(1-4)糖苷键来降解PG，使其成为小分子的可溶性片段。
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| 图 6 UPLC-TOFMS分析PG消化产物结果 Figure 6 UPLC-TOFMS analysis of PG digestion 注：A：PG被水解酶消化后可溶产物的UPLC分析，Tri：二糖三肽；Tetra：二糖四肽；Di：二糖二肽。B：通过电喷雾电离质谱法检测到的Tri的质量和推测的结构式。C：通过电喷雾电离质谱法检测Tetra的质量和推测的结构式。D：通过电喷雾电离质谱法检测Di的质量和推测的结构式 Note: A: The UPLC analysis of the soluble products after PG digestion. Tri: Disaccharide tripeptide; Tetra: Disaccharide tetrapeptide; Di: Disaccharide dipeptide. B: Mass of Tri detected by electrospray ionization mass spectrometry and predicted structural formula. C: Mass of Tetra detected by electrospray ionization mass spectrometry and predicted structural formula. D: Mass of Di detected by electrospray ionization mass spectrometry and predicted structural formula |
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表 3 经UPLC-TOFMS检测得到的PG消化后产物
Table 3 Products detected in UPLC-TOFMS after PG digestion
| 结构 Structure |
化学式 Chemical formula |
保留时间 Retention time (min) |
绝对质量 Exact mass (Da) |
理论检测质量 Calculated (m/z) |
实际检测质量 Measured (m/z) |
| Tri | C34H56N6O20 | 29.4 | 868.354 9 | 869.362 2 | 869.387 1 |
| Tetra | C37H61N7O21 | 37.9 | 939.392 1 | 940.399 3 | 940.427 1 |
| Di | C27H44N4O17 | 41.3 | 696.270 2 | 697.277 4 | 697.296 3 |
Ⅵ型分泌系统(T6SS)作为一种在革兰氏阴性菌中常见的分泌体系和细菌武器，可以通过其分泌的肽聚糖降解酶打破细菌细胞壁的屏障，致使受体细菌死亡。这一类溶菌酶到达受体细菌的周质空间后，可以靶向PG并且将其水解成可溶的小分子片段，导致细菌细胞壁骨架结构的裂解。本文探讨了2个T6SS效应蛋白TseH和VgrG3的作用机制，表明效应蛋白VgrG3可以有效降解PG，其作用位点是多糖链的N-乙酰葡糖胺和N-乙酰胞壁酸之间的β(1-4)糖苷键。本文还通过分析降解产物对PG的结构进行了合理的推测。
来源于霍乱弧菌中的T6SS结构蛋白VgrG3表现出对PG的体外降解活性。在之前的报道中，VgrG3体内表达的毒性是由其携带的氨基酸序列648-708区域跨膜结构域决定的[34]。然而本文发现，没有携带氨基酸序列648-708区域的C端截短突变体仍然表现出了较弱的体内表达的毒性，表明在VgrG3的毒性区域端可能具有未知的跨膜功能。虽然霍乱弧菌的效应蛋白TseH在细菌周质空间内表达时对细胞壁有破坏作用并且其结构与NlpC/P60-家族内肽酶类似[35]，但是在本文研究中TseH没有表现出水解纯化的细胞壁的体外活性。其中一个原因可能是体外实验中缺少一个未知的辅助因子，因此该蛋白的具体作用机理有待更进一步的研究。
关于细胞壁结构的相关报道已经阐明，PG骨架的结构由N-乙酰葡糖胺和N-乙酰胞壁酸组成的重复二糖单元构成，多糖链之间通过连接在N-乙酰胞壁酸上的多肽链相互交联形成稳定的网状结构。在本研究中，我们鉴定出PG的降解产物中主要成分是3种糖肽，这表明PG网状的骨架结构中存在许多未交联的多肽，相关报道[36]表明这可能与细菌对NaCl的敏感性有关。
综上所述，本研究建立了细胞壁PG的成分分析方法，揭示了靶向肽聚糖多糖链的T6SS效应蛋白VgrG3的作用位点，并表明PG的结构成分中存在一些未交联的多肽链。本研究的结果将有助于理解T6SS的杀菌机制及细菌细胞壁的结构组成，为后续研究细胞壁相关抗生素的作用机制提供一种可行的分析方法。同时，与商业化的溶菌酶相比，VgrG3体现出了高效降解PG的活性，说明VgrG3和其他类似的效应蛋白也具有广阔的应用潜力。
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