含氮杂环芳香化合物(N-heterocyclic aromatic compounds，NHACs)是工业溶剂、染料、药物以及杀虫剂的重要成分，通过人类活动进入环境，给地下水和土壤带来严重的污染^[1]。研究表明，NHACs对有机体有诱导突变甚至致癌的风险，因此，寻找有效途径降解环境中的含氮杂环化合物对于维护人类健康及保护生态环境具有重要意义^[2-5]。近年来研究发现，NHACs通过生物酶(羟基化酶/单加氧酶/氧化还原酶)的氧化还原过程降解成无害甚至有用的分子^[6]。

烟酸作为NHACs的模型，经常被用来研究微生物降解这类化合物的机理。在恶臭假单胞菌KT2440中，烟酸在羟基化酶NicAB作用下首先转化为6-羟基烟酸(6-HNA)，随后6-HNA在6-羟基烟酸3-单加氧酶NicC作用下通过氧化脱羧反应进一步被氧化成2, 5-二羟基吡啶(2, 5-DHP)，最后通过NicX/NicD/NicF/NicE的作用降解为延胡索酸(图 1)^[7-10]。其中，NicC是黄素依赖性单加氧酶，以FAD为辅基，以NADH为辅酶，但是NicC重组蛋白纯化和结构生物学方面的研究尚不十分明确，因此，研究NicC的结构对于揭示吡啶环β位单加氧酶识别含吡啶环底物并催化底物的吡啶环上β位羟基化的分子机理具有重要的生物学意义。

蛋白质分子是生物体生命活动的物质基础，是当前生命科学极为重要的研究对象。因此，蛋白质的分离与纯化是当前生命科学研究的热点领域。目前已发展了萃取法、沉淀法、离子交换层析法、分子印迹、膜分离等技术来分离和纯化蛋白质^[11]。另一方面，解析蛋白质的结构对深入探究其功能具有重要意义，而X射线衍射法是当前蛋白三维结构解析的重要办法，其难点在于高质量单晶的培养^[12]。

本研究通过构建表达载体和蛋白纯化得到高纯度野生型NicC蛋白和SeMet-NicC蛋白，并通过条件优化得到高质量蛋白单晶。此外，通过优化得到NicC蛋白与底物6-羟基烟酸的共晶，为解析NicC识别底物的分子机制和吡啶环β位羟基化的反应机理奠定了基础。

1 材料与方法 1.1 材料

1.1.1 质粒和菌株

质粒pET-28a(+)购自Novegen公司，恶臭假单胞菌株KT2440、E. coli DH5α和E. coli BL21(DE3)均为本实验室保存。

1.1.2 主要试剂和仪器及培养基

KOD-Neo-plus DNA聚合酶购自TOYOBO公司；限制性内切酶XhoⅠ/NdeⅠ购自NEB公司；T4 DNA连接酶购自TaKaRa公司；Ni²⁺-NTA填料和ÄKTA prime^TM Plus购自GE Healthcare公司；结晶试剂盒购自Hampton Research公司。PCR仪，杭州朗基科仪公司。

M9培养基(g/L)：十二水合磷酸氢二钠20.0，磷酸二氢钾60.0，氯化铵20.0，氯化钠10.0。

1.2 方法

1.2.1 引物设计、目的基因的PCR扩增与回收

以恶臭假单胞菌KT2440为模板，利用引物对1F (5ʹ- GCGCATATGATGCGGGGTAGGCAGAAA-3ʹ)和1149R (5ʹ-CGCCTCGAGTCATGCCGCCTCCCC GCT-3ʹ)进行PCR扩增。PCR反应体系：ddH₂O 30 μL，上、下游引物(10 μmol/L)各1.5 μL，模板(100 mmol/L) 2 μL，MgSO₄ (25 mmol/L) 4 μL，dNTPs (2 mmol/L) 5 μL，10×Buffer 5 μL，KOD plus酶(1.0 U/μL) 1 μL。PCR反应条件：94 ℃ 10 min；94 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，68 ℃ 40 s，32个循环；68 ℃ 10 min，4 ℃保存。

1.2.2 重组质粒pET28a-nicC的构建

将PCR片段和pET-28a(+)用限制性内切酶XhoⅠ和NdeⅠ进行双酶切，再用T4 DNA连接酶将目的片段和线性化的pET-28a(+)进行连接。将连接产物热激转化E. coli DH5α感受态细胞，筛选阳性克隆。菌落PCR鉴定后抽提质粒送北京擎科生物科技有限公司测序，经过BLAST比对确认为目标载体pET28a-nicC。

1.2.3 NicC蛋白的表达与纯化

将pET28a-nicC热激转化E. coli BL21(DE3)感受态细胞，挑取单克隆接入50 mL液体LB培养基，培养基中加入终浓度为50 μg/mL的卡那霉素，37 ℃、220 r/min培养过夜。将菌液扩大培养至1 L，待菌体OD₆₀₀为0.8−1.0时，加入1 mL 0.4 mol/L的IPTG，16 ℃、180 r/min诱导16 h。在4 ℃、4 000 r/min离心20 min收集菌体，用15− 20 mL Ni²⁺-NTA平衡缓冲液(25 mmol/L Tris，300 mmol/L NaCl，20 mmol/L咪唑pH 8.0)重悬菌体，加入终浓度为0.5 mmol/L的PMSF溶液。

将收集的菌液用高压破碎仪破碎(800− 900 bar，4 ℃，100 mL/5 min)，4 ℃、14 000 r/min离心45 min。取上清过Ni²⁺-NTA亲和层析柱，然后用Ni²⁺-NTA平衡缓冲液冲洗柱子，最后用洗脱液洗脱蛋白，取10 μL进行SDS-PAGE检测。将质量好的蛋白按照2 mg蛋白/1 U的比例，用凝血酶4 ℃过夜切割His-Tag，SDS-PAGE检测。再用凝胶过滤层析进一步除杂，借助ÄKTA prime^TM Plus收集蛋白洗脱液。UV检测蛋白质的洗脱情况，将紫外吸收峰对应的洗脱管分别取样进行SDS-PAGE分析，纯度高且均一性好的蛋白浓缩，液氮速冻，−80 ℃保存。

1.2.4 SeMet-NicC蛋白的表达和纯化

将pET28a-nicC热激转化甲硫氨酸缺陷型菌株E. coli B834感受态细胞，挑取单克隆接入50 mL液体LB培养基，加入终浓度为50 μg/mL的卡那霉素，37 ℃、220 r/min培养过夜。4 ℃、4 000 r/min离心10 min去上清，用50 mL M9培养基重悬，取5−10 mL菌液加入到灭菌的300 mL ddH₂O中，同时加入50 mL M9培养基，50 mL 20%的葡萄糖溶液，50 mL YNB溶液，40 mL 19种氨基酸的混合液，30 mg硒代甲硫氨酸粉末，加入终浓度为50 μg/mL的卡那霉素，37 ℃、220 r/min培养至OD₆₀₀为0.9−1.0。16 ℃、180 r/min诱导16 h，诱导时补加10 mL 19种氨基酸混合液，20 mg硒代甲硫氨酸粉末，1 mL 0.4 mol/L的IPTG。需要注意的是，蛋白洗脱后在洗脱液中加入终浓度为20 mmol/L的DTT，分子筛缓冲液中的DTT浓度增加到20 mmol/L，除此之外纯化方法与野生型相同。

1.2.5 蛋白结晶优化和X射线衍射

选用的结晶方法为悬滴法，使蛋白溶液与结晶试剂通过气象扩散达到平衡，形成晶核，从而长出晶体。具体方法为：在24孔板中加入200 μL结晶试剂，在硅化后的玻璃片上加1 μL蛋白溶液和1 μL结晶试剂，将玻璃片反扣在24孔板上，密封。在4 ℃培养3、7、10、15、30 d后分别在显微镜观察。选取形状好的晶体，加入合适的防冻保护剂冻存在液氮中，用X射线衍射获得晶体数据。

蛋白晶体的优化是基于晶体初筛的条件进行的，影响蛋白质结晶的因素有很多，但是一般根据初筛条件调节结晶试剂的pH值、沉淀剂的种类和浓度及盐的浓度，同时还要调整蛋白质的浓度。本实验结晶试剂的沉淀剂使用的是PEG4000和PEG3350，并设置29%−34%的6个梯度变化，pH值优化使用的是Tris-HCl Buffer Kit (pH 7.8−8.7)，采用正交试验对pH、沉淀剂和温度进行优化，确定最适生长条件。

晶体X射线的衍射数据在上海同步辐射光源(Shanghai synchrotron radiation facility, SSRF) BL19U1线站收集。

2 结果与分析 2.1 pET28a-nicC表达载体的构建和鉴定

nicC基因经过PCR扩增之后，用1%的琼脂糖凝胶电泳检测，可以看出在1 000−1 500 bp之间有一条与预期大小(1 149 bp)相符的条带(图 2A)。随机挑取平板上的转化子进行菌落PCR检测，4、5、7、8、9号转化子扩增出的片段与阳性对照大小相当，处在1 000−1 500 bp之间(图 2B)，抽提质粒测序，确定为目标克隆pET28a-nicC。

2.2 NicC蛋白的表达与纯化

Ni²⁺-NTA亲和层析的SDS-PAGE检测可以看出(图 3A)，在40、60、80、110、200 mmol/L咪唑洗脱液中45 kD处有条带，与目的蛋白(42.7 kD)大小接近，110 mmol/L和200 mmol/L咪唑洗脱液中NicC纯度较高，未见明显杂带，所以将110 mmol/L和200 mmol/L咪唑洗脱液合并。用凝血酶切除N端的6×His-Tag。凝血酶切除效果用SDS-PAGE检测(图 3B)，可以看出酶切之后的样品只有一条带，而且酶切之后的蛋白分子量明显比酶切前小，所以可以认为野生型NicC蛋白N端的6×His-Tag被凝血酶切割完全。

凝胶过滤层析结果表明，洗脱体积在70−90 mL (对应洗脱管数为65−73管)左右时有一个明显的紫外吸收峰，峰高350 mAu左右，对称尖细，取紫外吸收峰对应洗脱液进行SDS-PAGE检测(图 3C和3D)，可以看出蛋白的大小在45 kD左右，与目标蛋白大小一致，纯度高达90%，达到点晶标准。

2.3 SeMet-NicC蛋白的表达与纯化

将E. coli B834菌体破碎高速离心之后，取上清进行Ni²⁺-NTA亲和层析，将洗脱液用SDS-PAGE检测，所有咪唑洗脱液中都有SeMet-NicC蛋白(图 4A)。80、110、200、300、500 mmol/L咪唑洗脱液中杂蛋白较少，所以将其收集起来。用凝血酶切除N端的6×His-Tag，酶切后的SeMet-NicC进行SDS-PAGE检测，从酶切前后的对比中可以明显看出，酶切后的泳道中只有一条带，而且相比切前的样品，分子量稍小，说明SeMet-NicC蛋白N端的6×His-Tag被酶切完全(图 4B)。为了进一步除杂，将SeMet-NicC进行凝胶过滤层析，洗脱体积在105−123 mL (对应洗脱管为67−75管)时有一个明显的紫外吸收峰，峰高330 mAu左右，吸收峰尖细对称，将吸收峰对应的洗脱液用SDS-PAGE电泳检测(图 4C和4D)，可以明显看出蛋白质的含量高且纯度高，适合结晶。

2.4 蛋白结晶与X射线衍射

经过筛选，野生型NicC蛋白在Natrix 1第48号结晶试剂中有晶体生长，结晶条件为：蛋白浓度17.5 mg/mL，0.2 mol/L NH₄Cl，0.01 mol/L CaCl₂·2H₂O，0.05 mol/L Tris-HCl pH 8.5，30% PEG4000，4 ℃。单晶数量多，细碎如针尖，均匀地分散在结晶液滴中，不适合X射线衍射，需要进行进一步优化。

根据初筛条件进一步调整了结晶试剂中沉淀剂的浓度和pH值，在蛋白浓度为17.5 mg/mL、0.2 mol/L NH₄Cl、0.01 mol/L CaCl₂·2H₂O、31% PEG4000、0.05 mol/L Tris-HCl pH 8.0、4 ℃条件下得到晶体，相比于初筛条件，晶体的数量变少，体积变大，呈比较粗的杆状(图 5A)。

将结晶溶液中的PEG4000换为PEG3350，用晶种法对SeMet-NicC蛋白进行结晶，蛋白浓度为17.5 mg/mL、结晶溶液为0.2 mol/L NH₄Cl、0.01 mol/L CaCl₂·2H₂O、0.05 mol/L Tris-HCl pH 7.9、31% PEG3350、结晶温度为4 ℃时得到晶体，晶体表面光滑，呈杆状，体积更大，更加具有立体感(图 5C)。

用晶种法对NicC和6-HNA的混合溶液进行结晶，发现在蛋白浓度为17.5 mg/mL、结晶溶液为0.2 mol/L NH₄Cl、0.01 mol/L CaCl₂·2H₂O、0.05 mol/L Tris-HCl pH 7.9、31% PEG3350、结晶温度为4 ℃时有晶体生长，晶体为亮黄色，呈细长的杆状，表面光滑有光泽(图 5E)。

将优化的NicC晶体、SeMet-NicC晶体、NicC与6-HNA的共晶在上海同步辐射光源BL19U1进行X射线衍射，衍射图片见图 5B、5D、5F。

3 讨论与结论

蛋白质的分离纯化是研究其结构和功能的前提，也是当前生命科学研究的热点。本实验成功克隆pET28a-nicC重组质粒，并使用Ni²⁺-NTA亲和层析法和凝胶过滤层析法对所得蛋白进行分离纯化，得到较高纯度的NicC/SeMet-NicC蛋白。NicC蛋白的N端His-Tag的摆动会影响蛋白质堆积的稳定性，进而影响晶体的质量，加入凝血酶切除N端的His-Tag，可能会提高晶体的分辨率，对晶体的优化具有一定的参考价值。X射线衍射法是目前解析蛋白三维结构最直接的方法，其难点在于高质量蛋白单晶的获得。本研究通过晶体初筛和条件优化，确定了NicC蛋白的最适结晶条件(0.2 mol/L NH₄Cl，0.01 mol/L CaCl₂·2H₂O，31% PEG4000，0.05 mol/L Tris-HCl pH 8.0，4 ℃)。由于NicC的同源结构还没有被解析，无法通过分子置换的方法得到NicC的三维结构，所以尝试获得SeMet-NicC的单晶，以确定衍射过程中丢失的相位。通过结晶条件优化发现SeMet-NicC的最佳结晶条件为：0.2 mol/L NH₄Cl，0.01 mol/L CaCl₂·2H₂O，0.05 mol/L Tris-HCl pH 7.9，31% PEG3350，4 ℃。

蛋白与底物复合物共晶的获得对于揭示蛋白功能具有重要的意义^[13]。通过条件筛选优化发现，在0.2 mol/L NH₄Cl、0.01 mol/L CaCl₂·2H₂O、0.05 mol/L Tris-HCl pH 7.9、31% PEG3350、4 ℃条件下可获得NicC与6-HNA的共晶。

本研究对烟酸降解途径中的关键酶NicC进行了分离和纯化，得到了高纯度的NicC和SeMet-NicC蛋白，并通过结晶条件优化，得到高质量的NicC、SeMet-NicC的单晶和NicC与6-HNA的共晶，为解析NicC的三维结构并揭示其结构与功能之间的相互关系奠定了基础^[14]。