2020, Vol. 47扩展功能
文章信息
- 杨春璐, 闫鹏举, 魏宠, 史荣久, 韩斯琴, 张颖, 万传明
- YANG Chun-Lu, YAN Peng-Ju, WEI Chong, SHI Rong-Jiu, HAN Si-Qin, ZHANG Ying2, WAN Chuan-Ming
- 一株源自渤海海域高温酸败油井采出水的硫酸盐还原菌筛选与活性抑制
- Isolation and activity inhibition of a sulfate-reducing bacterium in produced water from an offshore high-temperature soured oilfield in the Bohai Sea area, China
- 微生物学通报, 2020, 47(5): 1332-1341
- Microbiology China, 2020, 47(5): 1332-1341
- DOI: 10.13344/j.microbiol.china.190206
-
文章历史
- 收稿日期: 2019-03-16
- 接受日期: 2019-05-05
- 网络首发日期: 2020-01-03
2. 中国科学院沈阳应用生态研究所<<<<辽宁<<沈阳<<<<110016;
3. 中国科学院污染生态与环境工程重点实验室<< <<辽宁<<沈阳<<<<110016
2. Institute of Applied Ecology, Chinese Academy of Sciences, Shenyang, Liaoning 110016, China;
3. Key Laboratory of Pollution Ecology and Environmental Engineering, Chinese Academy of Sciences, Shenyang, Liaoning 110016, China
硫酸盐还原菌(sulfate-reducing prokaryotes，SRP)是能够以硫酸根为唯一电子受体进行厌氧代谢产生H2S的多种微生物类群的统称[1]。基于16S rRNA基因比对分析结果，SRP分属于Deltaproteobacteria、Clostridia、Thermodesulfobacteria等7个进化分支，其中5个进化支为细菌域，2个进化支为古菌(Euryarchaeota和Crenarchaeota)。SRP种类多样，广泛栖息于油藏、沉积物等缺/厌氧环境中，且在碳、硫等元素的生物地球化学循环过程中发挥着至关重要的作用[1]。
在原油开采过程中，向地下油藏中注水来提高原油的采收率(简称“水驱”)是非常重要且常用的一种技术。对于海域油田而言，因地表水等水源供给限制，使用海水作为注入水开采石油是油田企业的必然选择。但是，海水中含有的大量硫酸盐(浓度约28 mmol/L)及其他营养物质，会随注入水进入地下油藏。在油藏环境中，由于可供SRP利用的有机碳源(电子供体)比较丰富(例如短链脂肪酸、烷烃、芳香烃等)，一旦持续引入硫酸盐则会大幅促进SRP的生长繁殖和代谢，从而产生高浓度的H2S[2-5]，导致油藏发生酸败(souring)。在油田开发过程中，由SRP引发的油藏酸败会产生许多生产、安全和环境问题[6-7]。例如，SRP的大量繁殖及代谢活动会导致油田金属设施(如采、输油管线)的微生物腐蚀加剧，由此增加原油泄漏及经济损失等问题发生的潜在风险，而产生的H2S不但降低原油及天然气的品质，还会严重危害工作人员的生命安全与身体健康。因此，几乎所有的油田企业均非常重视SRP的危害控制，但如何有效管控SRP在油田环境中的生长繁殖，降低甚至消除其危害一直是困扰油田开发工业的重要挑战之一[8-11]。
绝大多数油田企业主要通过向注入水中投加化学杀菌剂以杀灭SRP。较常用的化学杀菌剂包括戊二醛、四羟甲基硫酸磷{bis[tetrakis(hydroxymethyl)phosphonium] sulfate solution，THPS}等[7, 12-13]。尽管化学杀菌剂在杀灭注入水中SRP的效果好、起效快，但SRP会对该杀菌剂产生耐药性，从而降低杀菌的效果[11, 14]。可是如果继续提高杀菌剂用量，则会增加成本。此外，绝大多数化学杀菌剂为高环境毒性的化合物，其生产、运输及使用等环节均存在较高的安全、生态与环境损害风险[15]。另一方面，越来越多的研究显示，受油藏地质与环境条件异质性及开发方式的影响，不同油田环境中SRP的生物多样性和生理特性存在巨大差异，这些差异将对杀菌剂的选取及其工作浓度产生重要影响。因此，在深入了解特定油田SRP生理生态学具体实际的基础上，有针对性地开展杀菌剂筛选与效力评价等相关研究非常必要，也是有效提高油藏酸败控制技术效果的关键[7]。
我国渤海海域油气资源储量丰富。据不完全统计，目前已有超过1 000口采油井正在运营[16]。随着开采时间的延长，许多油井的采出液和天然气中均可检测到高浓度的H2S (其浓度可达103 mg/L数量级水平)及细胞数量达102-106 MPN/mL水平的SRP，表现出明显的微生物酸败特征。虽然一些学者已针对渤海海域油田H2S的成因、杀菌剂的筛选等开展了研究，但关于渤海海域油田油藏中SRP生理特点及危害控制的研究仍十分缺乏，现有认知仍非常有限[17]。本研究采用Hungate厌氧纯培养技术从渤海海域某高温油田酸败严重的生产平台采出水样品中筛选到一株数量占优势的硫酸盐还原菌，考察了该菌株的生理特性，并着重评价了几种化学杀菌剂(戊二醛、次氯酸钠、苄基三甲基氯化铵、溴硝醇和四羟甲基硫酸磷)对该菌株生长繁殖及产H2S活性的控制效力。本研究结果将有益于深化我国渤海海域高温油田环境中SRP及代谢特性的认识，同时为该区域油藏杀菌剂优选及酸败控制研究提供菌种资源支撑。
1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 油田采出水样品采集采出水样品取自渤海海域已发生酸败的某高温油田生产平台的一口采出井。截止到采样时，该采出井已经注海水(或海水采出水混注)开发6年，油井的其他基本情况及采出水的基本理化性质如表 1所示。采用预先除菌并充满高纯氮气(N2纯度≥99.99%)的高密度聚乙烯塑料桶(5.0 L)从井口端采集采出液，取样完成后迅速加盖密封并于4日内运抵实验室。样品运抵实验室后，立即在高纯氮气保护条件下完成油水分离，收集采出水用于SRP菌株分离和水质理化性质测定。
| 指标参数 Parameters |
数值 Quantitative value |
| SRP数量SRP estimates (MPN/mL) | 9.5×105 |
| 温度Temperature(℃) | 60 |
| 采出井深度Depth of well(m) | 1 568 |
| pH | 7.9 |
| SO42-质量浓度Sulfate concentration(mg/L) | 340 |
| 盐度(NaCl)Salinity(NaCl, mg/L) | 10 728 |
采用含有乳酸钠为碳源的培养基(简称M培养基)完成SRP的富集与筛选，采用简化培养基(简称N培养基)开展SRP纯菌株生理生化实验评价和杀菌剂效力评价，培养基的成分参见文献[17]。利用N培养基评价菌株碳源、电子受体利用能力时，用等量的待评测碳源和电子受体分别取代乳酸钠和硫酸镁；评价纯菌株在不同环境条件下的生长能力时，根据需要调整培养基中NaCl的用量和pH梯度(使用HCl或NaOH调节)。培养基的配制、分装等过程均按照厌氧微生物培养基制备方法[17-18]完成。实验过程中使用的厌氧管或厌氧瓶均采用丁基橡胶塞密封，再用铝盖压紧，瓶/管的顶空气体为高纯N2。
1.1.3 主要试剂和仪器细菌基因组DNA提取试剂盒，天根生化科技(北京)有限公司；琼脂糖凝胶纯化试剂盒、限制性内切酶Hae Ш和MspⅠ，宝生物工程(大连)有限公司。pH计，上海仪电科学仪器股份有限公司；分光光度计，PerkinElmer公司；PCR仪，耶拿公司；凝胶电泳系统，北京六一生物科技有限公司；超微量蛋白质核酸分析仪，Thermo Fisher Scientific公司，环境扫描电子显微镜，飞利浦公司；离子色谱仪(ICS-900)，戴安(中国)有限公司。
1.2 方法 1.2.1 SRP分离、优势菌株的生理特性及种属关系初步鉴定取无菌注射器吸取采出水5 mL接种至已预装95 mL液体M培养基的厌氧瓶中，再将培养瓶置于培养箱中于60 ℃条件下避光、静置培养。待培养瓶内液体变黑(SRP生长代谢所产生的H2S与培养基中含有的Fe2+形成了FeS黑色沉淀)后，取培养液转接至液体M培养基中连续进行10倍比梯度稀释(最低稀释度为10-8)，然后参照文献[18]报道的方法完成SRP纯菌株的分离筛选。在厌氧手套箱内小心挑取Hungate管内成功生长的SRP菌落，接种至含有9.5 mL液体M培养基的厌氧管中进行培养；此后，重复滚管分离及液体转接培养等步骤3-5次，期间通过显微镜观察结合16S rRNA基因测序结果确定菌株纯化效果。
纯菌株的基因组DNA提取参照试剂盒说明书完成。使用细菌通用引物27F (5′-AGAGTTTGAT CCTGGCTCAG-3′)和1492R (5′-GGTTACCTTGTT ACGACTT-3′)扩增16S rRNA基因，PCR扩增体系和条件参见文献[17]。获得PCR扩增产物后，使用琼脂糖凝胶纯化试剂盒进行纯化，再采用双酶切法(Hae Ш和MspⅠ)对扩增产物进行酶切分型。使用10%的聚丙烯酰胺凝胶电泳检测酶切产物，不同的电泳谱带类型视为不同的SRP “种”操作分类单元(operational taxonomic unit，OTU)，取特定OTU所对应纯菌株的PCR产物进行测序，测序由北京六合华大基因科技有限公司完成。经去除载体序列等处理后，采用BLASTn程序在GenBank数据库(www.ncbi.nlm.nih.gov/)进行16S rRNA基因序列相似性比对分析，同时将序列上传至GenBank数据库。根据比对结果，选取SRP菌株的近缘序列并采用MEGA X软件的Neighbor-Joining方法构建系统发育树，Bootstrap值设为1 000。
1.2.2 特定SRP菌体细胞形态与代谢特性通过扫描电镜观察优势SRP菌株细胞形态，样品制备及电镜扫描方法参见文献[17]。SRP菌株电镜拍照在中国科学院沈阳应用生态所分析检测中心完成。
参考《常见细菌鉴定手册》[19]完成优势SRP菌株生理生化特性的评测。共评测11种碳源(唯一电子供体)的利用能力，分别为乳酸钠、丙酸钠、乳糖、蔗糖、甘油、乙二醇、乙酸钠、果糖、丙酮酸钠、柠檬酸钠、葡萄糖；待评测的唯一电子受体分别为Na2SO3、Na2S2O3、单质硫。
考察优势SRP菌株在不同环境条件下的生长活性时，共设4个温度梯度，分别为25、37、45、60 ℃；设8个pH梯度，分别为3.0、5.0、6.0、8.0、9.0、10.0、11.0、12.0；设4个盐度梯度，培养基中NaCl终浓度分别为0.4%、1.0%、3.0%、5.0%，以考察菌株在不同盐度下产H2S能力。所有接菌处理中，SRP的接种量为5%，另设不接菌的处理组作为阴性对照，每个试验组均设3个重复。除了温度影响试验外，培养瓶均置于60 ℃条件下恒温、倒置、避光培养30 d，每10 d用无菌注射器取样测定培养液中的H2S浓度。
1.2.3 杀菌剂添加对优势SRP菌株产H2S活性及数量的影响为了评价杀菌剂对优势SRP菌株数量及产H2S活性的影响，共选取5种化学杀菌剂进行试验，分别为戊二醛、次氯酸钠、苄基三甲基氯化铵(benzyl trimethyl ammoniumchloride，BTAC)、溴硝醇和四羟甲基硫酸磷(THPS)，其添加剂量见表 2。取优势SRP菌株对数生长期菌液5.0 mL，转接至预装有95.0 mL液体M培养基的厌氧瓶中，然后使用无菌注射器向厌氧瓶内补加1.0 mL待评测杀菌剂溶液，使瓶内杀菌剂的终浓度达到表 2所示的各浓度梯度。厌氧瓶培养及H2S浓度测定同1.2.2；另选取代表性试验组，测定特定时间节点水样中SRP数量。除杀菌剂添加试验组外，还设有不添加杀菌剂的阴性对照组，所有处理组均设置3个重复。
| 杀菌剂 Biocide |
初始浓度 Initial concentration(mg/L) |
| 戊二醛Glutaraldehyde | 0, 30, 50, 100 |
| 次氯酸钠Sodium hypochlorite | 0, 200, 400, 600 |
| 苄基三甲基氯化铵BTAC | 0, 200, 400, 600 |
| 溴硝醇Bronopol | 0, 10, 30, 50 |
| 四羟甲基硫酸磷THPS | 0, 30, 60, 120 |
采用亚甲基蓝分光光度法(GB 13801-1992)[17]测定H2S浓度；使用离子色谱法测定硫酸根含量，色谱条件参见文献[17]。采用最大可能计数(most probale number，MPN)法测定采出水及各个实验组有关样品中SRP数量，每个稀释梯度设5个平行管。杀菌剂添加后，试验组与对照组间的差异通过重复测量单因素方差分析的方法进行检验，采用SPSS 20.0软件完成有关统计检验。
2 结果与分析 2.1 酸败油井采出水中的优势SRP菌经过多轮次Hungate滚管法从采出水中分离得到了42株SRP。基于16S rRNA基因的双酶切分型方法，共发现2种OTU类型(电泳结果未展示)，其中一种OTU类型包含38个菌株，为优势类群，另一种OTU仅包含4个菌株。此结果提示，从酸败油井采出水中筛选获得的42株硫酸盐还原菌可能仅分属两个不同的分类单元。从优势OTU类型对应菌株中挑取一株进行后续研究，其编号为WJ1。
2.2 菌株WJ1形态、系统发育地位及生理生化特点优势SRP菌株WJ1细胞的扫描电镜照片如图 1所示，该菌株细胞呈长杆状，菌体长度在2.0-5.5 μm之间。
|
| 图 1 硫酸盐还原菌菌株WJ1形态的扫描电镜图 Figure 1 Scanning electron micrograph showing the morphology of strain WJ1 |
|
|
菌株WJ1及其近缘菌种/株的系统发育树如图 2所示。菌株WJ1的16S rRNA基因序列(登录号为MK644261)与解糖泽恩根氏菌(Soehngenia saccharolytica)模式菌株BOR-YT[20]的16S rRNA基因序列一致性最高，达99%，提示两者系统发育的亲缘关系较近。
|
| 图 2 基于16S rRNA基因序列构建的菌株WJ1及其近缘菌株的Neighbor-Joining系统发育树 Figure 2 Neighbor-Joining tree showing the phylogenetic positions of strain WJ1 and representatives of some other related taxa, based on 16S rRNA gene sequences 注：分支节点数值为Bootstrap值(1 000次重复的百分比)；标尺表示碱基替换率. Note: The bootstrap values (expressed as percentages of 1 000 replications) are shown at branch nodes. Bar (0.005) shows the nucleotide substitution rate units. |
|
|
菌株WJ1生长代谢利用碳源、电子受体及部分生理生化特性如表 3所示。该菌株能够利用除果糖外的所有碳源进行生长代谢并产生H2S，最适碳源为丙酸钠；除了硫酸盐之外，WJ1还能分别利用Na2SO3、Na2S2O3为唯一电子受体产H2S，但不能利用单质硫。菌株WJ1具有运动性，不能够产生吲哚，明胶液化阳性。此外，菌株WJ1对氧气敏感，为严格厌氧菌。
| 实验项目Testing item | WJ1 | BOR-Y |
| 吲哚试验Indole production | - | + |
| 明胶液化Gelatin hydrolysis | + | - |
| 淀粉水解试验Starch hydrolysis | - | + |
| 运动性Mobility | + | + |
| H2S生成H2S production | + | + |
| 硫酸盐利用Utilization of sulfate | + | - |
| 亚硫酸盐利用Utilization of sulfite | + | + |
| 硫代硫酸盐利用Utilization of thiosulfate | + | + |
| 单质硫利用Utilization of sulfur | - | - |
| 耐氧性Aerotolerance | - | + |
| 葡萄糖Glucose | + | + |
| 甘油Glycerol | + | - |
| 乳糖Lactose | + | - |
| 蔗糖Sucrose | + | + |
| 乳酸盐Lactate | + | - |
| 乙酸盐Acetate | + | - |
| 丙酸钠Propionate | ++ | - |
| 乙二醇Glycol | + | - |
| 丙酮酸盐Pyruvate | + | + |
| 果糖Fructose | - | ND |
| 柠檬酸钠Citrate | + | + |
| 注：+：阳性或能利用；-：阴性或不利用；ND：未检测；BOR-YT：S. saccharolytica模式株. Note: +: Positive reaction; –: Negative reaction; ND: Not determined; BYR-RT: The type strain of S. saccharolytica. |
||
尽管WJ1与Soehngenia saccharolytica BOR-YT在16S rRNA基因序列上最相似，但两者在碳源利用、电子受体利用及其他生理生化特性上的差异明显(表 3)。
2.3 温度、pH及盐度对WJ1产H2S活性的影响菌株WJ1在不同环境条件下产H2S的活性如图 3所示。本文仅选取第30天的数据进行作图展示。菌株WJ1在25-60 ℃范围内均能产生H2S (图 3A)，表明该菌可在较宽环境温度条件下生长。菌株在37 ℃培养时产生H2S的量最大，提示WJ1的最适生长温度约为37 ℃；而在60 ℃培养时，尽管WJ1生长相对缓慢，但瓶内培养液中H2S浓度仍能达到37.3 mg/L，表明菌株可以耐受60 ℃高温条件。
|
| 图 3 WJ1在不同温度(A)、pH (B)及盐度(C)条件下产H2S活性(第30天) Figure 3 Sulfidogenic activity of strain WJ1 under various conditions of temperature (A), pH (B), and salinity (C) (Day 30) |
|
|
在pH为5.0-10.0时，菌株WJ1可生长且能产H2S (图 3B)，其最适pH约为8.0；当pH小于3.0或高于11.0时，WJ1几乎不能产生H2S。当NaCl浓度为0.4%-3%时，WJ1可生长并产H2S；而NaCl浓度为5%时，未检测到H2S生成(图 3C)。
2.4 杀菌剂添加对WJ1产H2S活性及菌体数量的影响如图 4A所示，当瓶内添加的戊二醛浓度高于30 mg/L时，WJ1在30 d的实验评价周期内不产H2S(P < 0.01)，该结果表明WJ1对戊二醛较为敏感。对杀菌剂作用前后WJ1菌体数量的监测结果同时显示，当30 mg/L的戊二醛与WJ1作用24 h后，菌体数量由初始的106 MPN/mL数量级水平降低至101 MPN/mL (表 4)。这些结果提示戊二醛具有高效抑制WJ1引起的高温油田酸败的潜力。
|
| 图 4 戊二醛(A)、次氯酸钠(B)、BTAC (C)、溴硝醇(D)及THPS (E)对WJ1产H2S活性的抑制效应 Figure 4 Inhibitory effects of glutaraldehyde (A), sodium hypochlorite (B), BTAC (C), bronopol (D), and THPS (E) on the sulfide production by strain WJ1 |
|
|
| 杀菌剂 Biocides |
使用前 Before (MPN/mL) |
使用后 After (MPN/mL) |
| 戊二醛 | 4.5×106 | 8.0×101 |
| Glutaraldehyde(30 mg/L) | ||
| 次氯酸钠 | 4.5×106 | 3.0×103 |
| Sodium hypochlorite(600 mg/L) | ||
| BTAC(600 mg/L) | 4.5×106 | 4.5×102 |
| 溴硝醇Bronopol(50 mg/L) | 4.5×106 | 0 |
| THPS(120 mg/L) | 4.5×106 | 2.0×101 |
尽管加入次氯酸钠后不同时间节点培养瓶内H2S浓度值显著低于不添加杀菌剂的对照组数值(P < 0.05)，但第30天时，添加200-600 mg/L次氯酸钠的各处理组培养瓶内H2S浓度均已达80 mg/L左右(图 4B)；与600 mg/L次氯酸钠接触24 h后，WJ1微生物数量由初始的106 MPN/mL数量级水平降低至103 MPN/mL (表 4)。该结果表明，次氯酸钠无法有效抑制WJ1的产H2S活性(图 4B)。
与次氯酸钠类似，添加BTAC后，培养瓶内杀菌剂初始浓度高达600 mg/L时WJ1仍能产生70 mg/L以上的H2S (图 4C)。第30天时，尽管不同浓度的添加组瓶内H2S浓度略低于对照组，但差异不显著(P>0.1)。与600 mg/L BATC接触24 h后，WJ1微生物数量由初始的106 MPN/mL数量级水平降低至102 MPN/mL (表 4)。
如图 4D所示，初始浓度为10 mg/L的溴硝醇在30 d内能显著抑制WJ1产生H2S (P < 0.01)；50 mg/L溴硝醇在24 h内的杀菌率达到100% (表 4)，表明溴硝醇抑制WJ1产H2S的效果较好。
添加30-60 mg/L THPS的处理组其H2S浓度与对照无显著差异(P>0.1)，第30天瓶内H2S浓度高达100 mg/L。当THPS初始浓度达到120 mg/L时，菌株WJ1在30 d内不产H2S (图 4E)。使用120 mg/L的THPS在24 h内将WJ1数量从106 MPN/mL数量级水平降低至101 MPN/mL (表 4)。
3 讨论SRP生长繁殖和代谢产生H2S被认为是导致油藏微生物酸败的根本原因[3, 7, 9]。因此，深入认识油藏环境中SRP的微生物学、生理学、生态学特点对于明确油藏酸败发生与发展的机制及研发有效的控制技术均具有重要意义。随着纯培养技术的改进及DNA测序技术的飞速发展，有关油藏环境中SRP的物种多样性、生理特性及活性抑制方面的研究逐渐增多[2-3]。海域油藏环境中栖息着多种SRP，可能受油藏地质及环境异质性等因素(如油藏温度、原油组分、油田注水开发历史等)的影响，不同油藏SRP的微生物多样性与生理活性等存在明显差异[7, 17]。本研究采用Hungate厌氧纯培养技术，从渤海海域已经发生微生物酸败的高温油田某采出井的采出水样品中分离到了一株SRP菌株WJ1。该菌株可以作为进一步认识渤海海域高温油田微生物酸败发生机制、杀菌剂优选评价的菌种资源。尽管如此，因受纯培养技术自身局限性的影响，本研究获得的菌株WJ1及有关认知极有可能仅是对渤海海域高温油田SRP总体的“管中窥豹”。在后续的研究中，仍有必要综合运用宏基因组学、宏转录组学等技术和方法获得该区域油田中SRP更全面和立体的科学认识。
3.1 WJ1近缘种——解糖泽恩根氏菌(S. saccharolytica)生理活性的差异菌株WJ1可耐受60 ℃高温条件，且在pH 8.0、盐度(NaCl)小于3%的条件下生长良好并产生H2S。上述环境条件与油藏及采出水环境条件相似(表 1)，提示菌株对于海域高温油藏环境条件的良好适应性。另一方面，菌株WJ1在25-37 ℃生长良好(图 3A)，但不能在65 ℃以上温度下生长(数据未展示)，提示该菌株可能并非油藏的原生菌群，可能来自于海水环境而随注水过程进入油藏并定殖于此。
16S rRNA基因序列比对结果显示，WJ1与S. saccharolytica BOR-YT的序列一致性最高(99%)，但与油田环境中常见SRP种属(如Desulfovibrio vulgaris)的序列一致性较低(< 90%)。该结果提示，菌株WJ1与S. saccharolytica的亲缘关系可能更近。尽管如此，WJ1表现出了耐高温、耐酸碱等生理特性，这与S. saccharolytica模式菌株BOR-YT的差异明显：(1) WJ1能够耐受60 ℃的高温(图 2A)，而BOR-YT的最高耐受温度40 ℃；(2) BOR-YT适应的pH范围是6.0-7.5，最适pH为7.0，但WJ1能在pH为5.0–10.0的范围内生长及代谢(图 2B)，最适生长的pH值为8.0；(3) WJ1能够以硫酸盐为唯一电子受体进行厌氧呼吸产生H2S，但是BOR-YT不能利用硫酸盐；WJ1能够利用乙酸、丙酸为唯一碳源进行生长，但是BOR-YT不能利用小分子的脂肪酸和乙酸盐[20]。这些生理特性上的差异可能由于WJ1长期适应渤海海域油藏内高温厌氧高盐环境条件而导致。另一方面，在未来的研究工作中，非常有必要通过全基因组测序或者DNA-DNA杂交的方法进一步确定菌株WJ1的系统发育地位。
3.2 杀菌剂的剂量对于抑制硫酸盐还原菌代谢活性的差异有研究显示，当戊二醛浓度达到500 mg/L或者溴硝醇浓度达到800 mg/L时才能抑制加拿大Coleville油田中SRP的代谢活性[21]。然而在本实验中，添加低剂量的戊二醛(30 mg/L)、溴硝醇(10 mg/L)就能够高效抑制SRP产H2S的活性。另有报道显示，在印度Kathloni油田单独使用25 mg/L的次氯酸钠或苄基三甲基氯化铵(BTAC)在2 h内SRP (初始数量达108 MPN/mL)的杀菌率可达100%[22]。但在本研究中，即使次氯酸钠、BTAC浓度高达600 mg/L仍无法有效抑制WJ1活性(虽然菌株WJ1的初始浓度为106 MPN/mL，低2个数量级)。这些研究结果表明同一杀菌剂杀灭不同油田的SRP或抑制SRP产H2S活性的效果存在明显差异。其原因可能与不同油田中SRP的多样性及组成、杀菌剂选择及应用历史、油藏水环境条件及开发方式等因素有关[23]。这些结果从另一个角度说明，控制油田SRP的危害，有必要针对特定油藏的实际环境及SRP特点进行针对性的研发。本研究结果显示，较低浓度的溴硝醇、戊二醛和THPS能够高效地抑制渤海海域高温油藏中优势SRP菌株产H2S的活性(图 4)，大幅降低细菌数量(表 4)，这些杀菌剂在此区域油藏酸败控制中具有较好的应用潜力。需要注意的是，有必要通过小规模工业试验进一步评价杀菌剂的实际应用效力、经济性及对其他采油过程的影响。
4 结论本研究采用纯培养技术从渤海湾某高温酸败采出井的采出水中筛选SRP，对优势菌株的形态特征、生理特征和系统发育地位进行了初步探讨，并着重考察了不同杀菌剂对其产H2S活性的抑制效果，获得主要结论为：
(1) 渤海海域高温酸败油井采出水中优势SRP菌株WJ1的16S rRNA基因与解糖泽恩根氏菌(S. saccharolytica) BOR-YT序列一致性最高，达99%。
(2) WJ1可在25-45 ℃、pH 8.0、盐度(NaCl)小于3%的条件下生长良好，产生H2S，可耐受60 ℃高温，但在温度大于65 ℃、pH小于5.0或大于11.0、盐度大于5%条件下几乎不能生长；除硫酸盐之外，菌株WJ1可以利用亚硫酸盐、硫代硫酸盐分别作为唯一电子受体产生H2S。
(3) 单独添加终浓度为30 mg/L的戊二醛、10 mg/L的溴硝醇或120 mg/L的THPS可抑制初始细胞浓度为106 MPN/mL的WJ1产H2S活性达30 d以上。溴硝醇、戊二醛、THPS是控制该酸败油井的潜在有效杀菌剂。
| [1] |
Muyzer G, Stams AJM. The ecology and biotechnology of sulphate-reducing bacteria[J]. Nature Reviews Microbiology, 2008, 6(6): 441-454. DOI:10.1038/nrmicro1892 |
| [2] |
Kamarisima, Miyanaga K, Tanji Y. The utilization of aromatic hydrocarbon by nitrate- and sulfate-reducing bacteria in single and multiple nitrate injection for souring control[J]. Biochemical Engineering Journal, 2019, 143: 75-80. DOI:10.1016/j.bej.2018.12.006 |
| [3] |
Hubert C, Voordouw G. Oil field souring control by nitrate-reducing Sulfurospirillum spp. that outcompete sulfate-reducing bacteria for organic electron donors[J]. Applied and Environmental Microbiology, 2007, 73(8): 2644-2652. DOI:10.1128/AEM.02332-06 |
| [4] |
Prajapat G, Rellegadla S, Jain S, et al. Reservoir souring control using benzalkonium chloride and nitrate in bioreactors simulating oil fields of western India[J]. International Biodeterioration & Biodegradation, 2018, 132: 30-39. |
| [5] |
Shen Y, Agrawal A, Suri NK, et al. Control of microbial sulfide production by limiting sulfate dispersal in a water-injected oil field[J]. Journal of Biotechnology, 2018, 266: 14-19. DOI:10.1016/j.jbiotec.2017.11.016 |
| [6] |
Enning D, Venzlaff H, Garrelfs J, et al. Marine sulfate-reducing bacteria cause serious corrosion of iron under electroconductive biogenic mineral crust[J]. Environmental Microbiology, 2012, 14(7): 1772-1787. DOI:10.1111/j.1462-2920.2012.02778.x |
| [7] |
Gieg LM, Jack TR, Foght JM. Biological souring and mitigation in oil reservoirs[J]. Applied Microbiology and Biotechnology, 2011, 92(2): 263-282. |
| [8] |
Tsesmetzis N, Alsop EB, Vigneron A, et al. Microbial community analysis of three hydrocarbon reservoir cores provides valuable insights for the assessment of reservoir souring potential[J]. International Biodeterioration & Biodegradation, 2018, 126: 177-188. |
| [9] |
Tang K, Baskaran V, Nemati M. Bacteria of the sulphur cycle: An overview of microbiology, biokinetics and their role in petroleum and mining industries[J]. Biochemical Engineering Journal, 2009, 44(1): 73-94. DOI:10.1016/j.bej.2008.12.011 |
| [10] |
Kaster KM, Grigoriyan A, Jenneman G, et al. Effect of nitrate and nitrite on sulfide production by two thermophilic, sulfate-reducing enrichments from an oil field in the North Sea[J]. Applied Microbiology and Biotechnology, 2007, 75(1): 235. |
| [11] |
Youssef N, Elshahed MS, Mcinerney MJ. Microbial processes in oil fields: culprits, problems, and opportunities[A]//Laskin AI, Sariaslani S, Gadd GM. Advances in Applied Microbiology[M]. Burlington: Academic Press, 2009: 141
|
| [12] |
Schwermer CU, Lavik G, Abed RMM, et al. Impact of nitrate on the structure and function of bacterial biofilm communities in pipelines used for injection of seawater into oil fields[J]. Applied and Environmental Microbiology, 2008, 74(9): 2841-2851. DOI:10.1128/AEM.02027-07 |
| [13] |
Yang BC, Yang MT, Qi YF, et al. Development of new low-cost oil field fungicide[J]. China Petrochemistry, 2016(24): 73-74. 杨冰川, 杨美田, 齐元峰, 等. 新型低成本油田杀菌剂的研制[J]. 中国石油石化, 2016(24): 73-74. DOI:10.3969/j.issn.1671-7708.2016.24.024 |
| [14] |
Thauer RK, Stackebrandt E, Hamilton WA. Energy metabolism phylogenetic diversity of sulphate-reducing bacteria[A]//Barton LL, Hamilton WA. Sulphate-Reducing Bacteria: Environmental and Engineered Systems[M]. Cambridge: Cambridge University Press, 2007: 1
|
| [15] |
Xu J, Jia R, Yang DQ, et al. Effects of D-phenylalanine as a biocide enhancer of THPS against the microbiologically influenced corrosion of C1018 carbon steel[J]. Journal of Materials Science & Technology, 2019, 35(1): 109-117. |
| [16] |
Deng YH, Xue YA, Yu S, et al. Shallow hydrocarbon migration and accumulation theory and discovery of giant oilfield group in Bohai Sea[J]. Acta Petrolei Sinica, 2017, 38(1): 1-8. 邓运华, 薛永安, 于水, 等. 浅层油气运聚理论与渤海大油田群的发现[J]. 石油学报, 2017, 38(1): 1-8. |
| [17] |
Yang CL, Yuan MY, Shi RJ, et al. A Thermotolerant and halotolerant sulfate-reducing bacterium in produced water from an offshore high-temperature oilfield in Bohai Bay, China: isolation, phenotypic characterization, and inhibition[J]. Environmental Science, 2018, 39(10): 4783-4792. 杨春璐, 苑美玉, 史荣久, 等. 海域高温油田1株耐高温耐盐硫酸盐还原菌的筛选与生理特性及活性抑制[J]. 环境科学, 2018, 39(10): 4783-4792. |
| [18] |
Miller TL, Wolin MJA. Serum bottle modification of the Hungate technique for cultivating obligate anaerobes[J]. Applied Microbiology, 1974, 27(5): 985-987. DOI:10.1128/AEM.27.5.985-987.1974 |
| [19] |
Dong XZ, Cai MY. Manual for Systematic Identification of Common Bacteria[M]. Beijing: Science Press, 2005. 东秀珠, 蔡妙英. 常见细菌系统鉴定手册[M]. 北京: 地震出版社, 2005. |
| [20] |
Parshina SN, Kleerebezem R, Sanz JL, et al. Soehngenia saccharolytica gen. nov., sp. nov. and Clostridium amygdalinum sp. nov., two novel anaerobic, benzaldehyde-converting bacteria[J]. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology, 2003, 53(6): 1791-1799. DOI:10.1099/ijs.0.02668-0 |
| [21] |
Greene EA, Brunelle V, Jenneman GE, et al. Synergistic inhibition of microbial sulfide production by combinations of the metabolic inhibitor nitrite and biocides[J]. Applied and Environmental Microbiology, 2006, 72(12): 7897-7901. DOI:10.1128/AEM.01526-06 |
| [22] |
Kaur G, Mandal AK, Nihlani MC, et al. Control of sulfidogenic bacteria in produced water from the Kathloni oilfield in northeast India[J]. International Biodeterioration & Biodegradation, 2009, 63(2): 151-155. |
| [23] |
Agrawal A, Vanbroekhoven K, Lal B. Diversity of culturable sulfidogenic bacteria in two oil-water separation tanks in the north-eastern oil fields of India[J]. Anaerobe, 2010, 16(1): 12-18. DOI:10.1016/j.anaerobe.2009.04.005 |