微生物学通报  2020, Vol. 47 Issue (3): 782−791
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牛结核病(bovine tuberculosis)是“国家中长期动物疫病防治规划(2012−2020年)”16种优先防治的国内重大动物疫病之一，我国将其列为二类动物疫病，世界动物卫生组织(Word Organisation for Animal Health，OIE)将其列为法定报告的动物疫病。牛结核病是以渐进性消瘦、咳嗽、多种组织器官形成干酪样坏死或钙化结节为特征的一种人兽共患慢性肉芽肿性传染病[1-2]。该病主要由结核分枝杆菌复合群成员——牛分枝杆菌感染引起，此菌也可以感染包括人在内的大部分哺乳动物。在基因组水平上，牛分枝杆菌和结核分枝杆菌一致性达到99.95%，而禽分枝杆菌一般认为对牛不致病，但感染后可干扰牛结核病的检疫[1]。
近几年，有关部门对我国牛场结核病的流行病学进行调查，发现我国牛结核病的发病率一直呈现上升态势[2]。当前，牛结核病的防控主要采取“检疫-淘汰”方法。国内外用于诊断牛结核病的检测方法大体上可分为三大类[3]：一是基于细菌学检测方法，如细菌染色涂片镜检、细菌培养和细菌接种易感动物试验等；二是基于免疫学的检测方法，如结核菌素皮内变态反应试验、IFN-γ释放试验和胶体金试验等；三是基于分子生物学的诊断技术，如基因芯片、核酸探针、PCR等方法。到目前为止，世界动物卫生组织推荐的牛结核病诊断方法只有结核菌素(purified protein derivatives，PPD)变态反应，但该方法存在很多弊端，除检验时间长(72 h)、主观判断性强(测皮厚)的缺点外，还存在非典型分枝杆菌干扰，常造成非特异性反应的发生[4-5]。细菌分离培养是牛结核病诊断的“金标准”，但分枝杆菌培养基要求高，而且培养时间长(初次培养一般至少3周以上)、分离率低，已不能满足现代临床诊断的需要。
近年来，随着分子生物学技术的发展以及结核杆菌特异性核苷酸序列分析所取得的成果，通过基因扩增进行结核分枝杆菌的鉴定已成为该类菌鉴定最可靠的技术方法之一[6-7]。2003年，王仲元等[8]用3套分枝杆菌特异引物，在同一退火温度下同时扩增菌株的基因组DNA，一次性将结核分枝杆菌、牛分枝杆菌与非结核分枝杆菌区别开，取得了很好的效果，特异性达到100%，灵敏度为10 ng/反应。2007年，谢芝勋等[9]根据牛布鲁氏菌具有种特异性的BCSP-31K基因和牛分枝杆菌23S rRNA基因，设计并合成了两对分别扩增牛布鲁氏菌和牛分枝杆菌的特异性引物，建立了PCR同时快速检测鉴别以上两种病原体的方法。2013年，张喜悦等[10]用MYCGEN引物检测临床分离菌株，扩增有1 030 bp片段的目的基因，证实分离菌株属于MTC (mycobacterium tuberculosis complex)群。2016年，岳筠等[11]选择牛分枝杆菌保守基因区域合成特异性引物，构建了可检测牛分枝杆菌病原核酸的PCR方法，均具有良好的敏感性和特异性，可用于鲜乳样本的检测。2019年，Barandiaran等[12]等分别用PCR方法和细菌分离培养法检测了266份猪组织样本中的牛型分枝杆菌，结果显示PCR方法的灵敏度(82.9%)高于细菌分离培养的灵敏度(79.9%)，两种方法的特异性几乎相同，证实PCR可以作为一种检测猪的牛型分枝杆菌的快检方法。
在牛结核病流行病学中，患病奶牛是结核病的重要传染源，牛主要通过患病呼吸道分泌物和咳嗽所产生的气溶胶感染；人则主要通过食用未经高温处理的病牛的肉或奶感染[1, 13]。因此，对疑似患病牛牛奶或屠宰组织样品进行快速检验确诊，对于防范该病及其畜产品扩散、蔓延，具有非常重要的公共卫生意义。鉴于此，依据传统的流行病学、临床症状、病理变化或PPD试验做出初步诊断后，通过病原学PCR检测进行牛结核病确诊，对于最大限度地减少奶牛养殖业乳品生产业的经济损失，意义重大。
本研究对已报道的5对引物，运用牛分枝杆菌标准菌株及人工模拟临床样本(淋巴结、肺脏和牛奶)系统比较了其敏感性和特异性，为畜牧业从业者和科研工作者快速准确诊断牛结核病提供指导。
1 材料与方法 1.1 材料牛分枝杆菌AN5 (国际牛结核菌素生产用菌株)、牛分枝杆菌C68001 (国内牛结核菌素生产用菌株)、参考菌株牛种布鲁氏菌2308株、羊种布鲁氏菌Rev.1株、禽分枝杆菌C68202株、胞内分枝杆菌C68226株、副结核分枝杆菌Ⅲ-Ⅴ (C68681)株，均由中国兽医药品监察所鉴定、保管和供应。
组织核酸提取试剂盒，Qiagen公司；细菌基因组提取试剂盒，天根生物技术有限公司；溶菌酶，索莱宝生物科技有限公司；PreTaq mix，TaKaRa公司；大豆酪蛋白琼脂TSA，Oxoid公司；细菌浊度标准对照品，中国药品生物制品检定所。NanoDrop核酸测定仪，Thermo公司。
健康牛组织样本，本实验采集并保存；全脂牛奶(蒙牛)，购自超市。
佩氏培养基、大豆酪蛋白琼脂平板(TSA)购自中国兽医药品监察所。
1.2 引物合成用表 1中引物扩增特异性基因片段。
| 引物编号 Primers No. |
靶基因 Target gene |
引物名称 Primers name |
序列 Sequences (5′→3′) |
扩增长度 Sizes (bp) |
参考文献 References |
| 1 | Mycgen | Mycgen-F | AGAGTTTGATCCTGGCTCAG | 1 030 | [10] |
| Mycgen-R | TGCACACAGGCCACAAGGGA | ||||
| 2 | IS6110 | IS6110-F | GGATCCTGCGAGCGTAGGCG | 323 | [11] |
| IS6110-R | CATCAGCCGCGTCCACGC | ||||
| 3 | 23S rRNA | 23S rRna-F | GCGAACGCGGAACAGGCTAAAC | 838 | [9] |
| 23S rRna-R | AGCTTATCCCCCGCCGTCTCA | ||||
| 4 | α antigen gene | MT-F | TTCCTACCAGCGAGCTGCCG | 500 | [8] |
| MT-R | CCCCAGTACTCCCAGCTGTGC | ||||
| 5 | IS6110 | IS-F | CGGAGACGGTGCGTAAGTGG | 1 000 | [8] |
| IS-R | GATGGACCGCCAGGGCTTGC |
采用生物信息学软件DNAStar评价5对引物Tm，确定其退火温度范围；然后采用降落PCR扩增。PCR反应体系(20 μL)：模板1 μL，上、下游引物(10 μmol/L)各1 μL，ddH2O 7 μL，2×Taq mix (0.1 U/μL) 10 μL。PCR反应条件：95 ℃ 5 min；95 ℃ 30 s，53−63 ℃ (每循环降落1 ℃) 30 s；72 ℃ 1 min，34次循环；72 ℃ 10 min；4 ℃保存。依据PCR结果选取确定适宜的退火温度。
1.4 敏感性试验 1.4.1 细菌核酸最小检测量确定(1) 菌液培养、核酸提取。将牛分枝杆菌C68001株冻干菌株用0.3 mL蛋白胨水溶解，密集划线接种2支佩氏培养基斜面，37 ℃培养1个月[14]。肉眼观察长出干燥颗粒状结核菌落且生长纯粹后，用5 mL生理盐水洗下，80 ℃水浴灭活2 h，备用。按照细菌基因组提取试剂盒说明书提取核酸，测定其浓度。
(2) 最小检测量确定。用PBS将核酸浓度依次稀释为10−3、10−4……10−10 ng/μL，阴性对照为ddH2O，依据1.3获得的适宜Tm及反应条件进行PCR，确定不同引物PCR方法的核酸最小检测量。
1.4.2 人工模拟临床样本最小检测量确定(1) 人工模拟感染组织样本(肺脏/淋巴结)检测。将灭活的C68001菌液依次2×梯度稀释后测定其OD600值，确定其初始浓度，并稀释到108 CFU/mL，然后用PBS进行10×倍比稀释，依次分别加入到肺脏/淋巴结组织匀浆(100 μL)中，每份匀浆加入10 μL稀释菌液，随后分别用组织核酸提取试剂盒提取核酸后进行PCR检测，依据1.3获得的适宜Tm进行PCR，确定不同引物PCR方法对组织中核酸的最小检测量。
(2) 人工模拟感染牛奶样本检测。将(1)中稀释各浓度的菌液，依次分别加入到1 mL全脂牛奶中，每份加入10 μL稀释菌液，然后分别用组织核酸提取试剂盒提取核酸后进行PCR检测，依据1.3获得的适宜Tm进行PCR，确定不同引物PCR方法对牛奶中核酸的最小检测量。
1.5 特异性试验 1.5.1 菌液培养及核酸提取将牛分枝杆菌C68001株、牛分枝杆菌AN5株、禽分枝杆菌C68202株、胞内分枝杆菌C68226株和副结核分枝杆菌C68681株按1.4.1方法进行培养并提取核酸。牛种布鲁氏菌2308株、羊种布鲁氏菌Rev.1株分别接种大豆酪蛋白琼脂平板(TSA)，37 ℃培养3 d后，用5 mL生理盐水洗下，80 ℃水浴灭活2 h，再按1.4.1方法提取核酸。
1.5.2 PCR方法检测按1.3获得的适宜Tm进行PCR，分别对上述菌株核酸进行检测，并设相同条件灭菌ddH2O对照，以确定PCR方法的特异性。
2 结果与分析 2.1 适宜退火温度Tm的确定经过生物信息学软件DNAStar分析得出，5对引物的Tm范围在53−63 ℃之间，在此范围内设置温度梯度，每循环降落1 ℃，以C68001核酸为模板进行PCR扩增。结果显示，5对引物在53−63 ℃退火范围内均能扩出目的条带(图 1)。综合考虑，选择60 ℃作为5对引物的最佳退火温度，并建立PCR反应条件：95 ℃ 5 min；95 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，30次循环；72 ℃ 10 min；4 ℃保存。
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| 图 1 不同引物退火温度的确定 Figure 1 Determination of annealing temperature of different primers 注：N：阴性对照；M：DNA分子质量标准DL2000；1−11：退火温度分别为53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63 ℃. A：1号引物；B：2号引物；C：3号引物；D：4号引物；E：5号引物. Note: N: Negative control (ddH2O); M: DL2000 DNA Marker; 1−11: The annealing temperature is 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62 or 63 ℃. A: Primers number 1; B: Primers number 2; C: Primers number 3; D: Primers number 4; E: Primers number 5. |
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提取牛分枝杆菌C68001株核酸，用NanoDrop核酸测定仪测其浓度为33.3 ng/μL，用PBS将核酸稀释至10−3 ng/μL，然后依次进行10×倍比稀释，浓度依次为10−3、10−4……10−10 ng/μL，依据2.1建立的PCR反应条件分别进行PCR，确定不同引物PCR方法的最小核酸检测量。
从PCR结果能够看出(图 2)，1号和3号引物对C68001基因组的检测灵敏度最高，达到10−10 ng/μL甚至更低的检出限；其次是2号和5号引物，可以达到10−5 ng/μL；4号引物可以检出最小10−4 ng/μL的核酸。
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| 图 2 不同引物对细菌核酸的敏感性 Figure 2 Sensitivity of different primers to bacterial nucleic acids 注：M：DNA分子质量标准DL2000；1−8：核酸浓度依次为10−3、10−4、10−5、10−6、10−7、10−8、10−9、10−10 ng/μL. A：1号引物；B：2号引物；C：3号引物；D：4号引物；E：5号引物. Note: M: DL2000 DNA Marker; 1−8: The concentration of DNA is 10−3, 10−4, 10−5, 10−6, 10−7, 10−8, 10−9 or 10−10 ng/μL. A: Primers number 1; B: Primers number 2; C: Primers number 3; D: Primers number 4; E: Primers number 5. |
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(1) 人工模拟感染组织样本(肺脏/淋巴结)检测。将灭活的C68001菌液测定OD600值，确定其初始浓度，当菌液稀释16倍时浓度是25×108 CFU/mL，用PBS将菌液稀释至108 CFU/mL并依次进行10×倍比稀释，取10 μL稀释菌液依次分别加入到肺脏和淋巴结组织匀浆(100 μL)中，提取核酸后进行PCR检测，从而确定不同引物PCR方法对组织中核酸最小检测量(图 3和图 4)。结果显示：1号、3号和4号引物对淋巴结和肺中牛分枝杆菌(C68001)的检测灵敏度最高，达到10个菌/mL甚至更低的检出限；其次是2号引物，可以检出100个菌/mL；5号引物灵敏度最低。
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| 图 3 不同引物对肺脏中C68001核酸的检测敏感性 Figure 3 Sensitivity of different primers to detection of C68001 nucleic acid in lung 注：M：DNA分子质量标准DL1000；1−8：菌液浓度依次为108、107、106、105、104、103、102、101个/mL. A：1号引物；B：2号引物；C：3号引物；D：4号引物；E：5号引物. Note: M: DL1000 DNA Marker; 1−8: The CFU of bacteria is 108, 107, 106, 105, 104, 103, 102 or 101 CFU/mL. A: Primers number 1; B: Primers number 2; C: Primers number 3; D: Primers number 4; E: Primers number 5. |
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| 图 4 不同引物对淋巴结中C68001核酸的检测敏感性 Figure 4 Sensitivity of different primers to detection of C68001 nucleic acid in lymph nodes 注：M：DNA分子质量标准DL1000；1−8：菌液浓度依次为108、107、106、105、104、103、102、101个/mL. A：1号引物；B：2号引物；C：3号引物；D：4号引物；E：5号引物. Note: N: M: DL1000 DNA Marker; 1−8: The CFU of bacteria is 108, 107, 106, 105, 104, 103, 102 or 101 CFU/mL. A: Primers number 1; B: Primers number 2; C: Primers number 3; D: Primers number 4; E: Primers number 5. |
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(2) 人工模拟感染牛奶样本检测。将1.4.2 (1)稀释各浓度的菌液分别取10 μL，依次分别加入到1 mL全脂牛奶中，提取核酸后进行PCR检测，确定不同引物PCR方法对牛奶中核酸最小检测量(图 5)。结果显示2号、3号、4号和5号引物对人工模拟奶样中牛结核菌(C68001)的检测灵敏度都可以达到10个菌/mL；1号引物检测奶样的灵敏度较低，只有106个菌/mL。
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| 图 5 不同引物对人工模拟奶样的灵敏度检测 Figure 5 Sensitivity of different primers to detection of C68001 nucleic acid in milk samples 注：M：DNA分子质量标准DL2000；1−8：菌液浓度依次为108、107、106、105、104、103、102、101个/mL. A：1号引物；B：2号引物；C：3号引物；D：4号引物；E：5号引物. Note: N: M: DL2000 DNA Marker; 1−8: The CFU of bacteria is 108, 107, 106, 105, 104, 103, 102, 101 CFU/mL. A: Primers number 1; B: Primers number 2; C: Primers number 3; D: Primers number 4; E: Primers number 5. |
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用牛种布鲁氏菌2308株、羊种布鲁氏菌Rev.1株、牛分枝杆菌(C68001)、牛分枝杆菌(AN5)、禽分枝杆菌(C68202)、副结核分枝杆菌(C68681)和胞内分枝杆菌(C68226)的核酸进行特异性检测，用ddH2O作为阴性对照，结果显示(图 6) 2号和5号引物只与两种牛分枝杆菌发生强烈反应，与禽结核分枝杆菌反应较弱，与布鲁氏菌、副结核分枝杆菌和胞内分枝杆菌均不反应，而禽分枝杆菌一般不会感染牛，所以这2对引物可用于牛型分枝杆菌的检测；而1号、3号和4号引物与布鲁氏菌外的其他5种分枝杆菌均发生强烈反应，所以不适合作为牛结核PCR检测的引物。
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| 图 6 引物特异性的检测 Figure 6 Detection of primer specificity 注：1：牛种布鲁氏菌2308；2：羊种布鲁氏菌Rev.1；3：牛分枝杆菌C68001；4：牛分枝杆菌AN5；5：禽分枝杆菌C68202；6:副结核分枝杆菌C68681；7：胞内分枝杆菌C68226；8：阴性对照；M：DNA分子质量DL2000. A：1号引物；B：2号引物；C：3号引物；D：4号引物；E：5号引物. Note: 1: Brucella abortus 2308; 2: Brucella melitensis Rev.1; 3: Mycobacterium bovis C68001; 4: Mycobacterium bovis AN5; 5: Mycobacterium avium C68202; 6: Mycobaterium paratuberculosis C68681; 7: Mycobacterium intracellulare C68226; 8: Negative control (ddH2O); M: DNA DL2000 Marker. A: Primers number 1; B: Primers number 2; C: Primers number 3; D: Primers number 4; E: Primers number 5. |
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牛结核病是主要由结核分枝杆菌复合群(Mycobacterium tuberculosis complex，MTC)中的牛分枝杆菌引起的一种慢性、消耗性人畜共患病[1]。淋巴结和肺脏是牛结核病重要的靶组织，而乳液是牛结核病风险评估中最易采集、最容易监测的样本[11, 13]。屠宰检疫中，通过肺脏等相关组织及淋巴结的特征性变化初诊后运用PCR确诊，是防止感染牛肉进入市场的最后环节。乳液PCR筛查对于最大限度地减少奶牛养殖业和乳品生产业的经济损失意义重大。
3.2 引物是建立PCR方法的关键，不同引物其敏感性及特异性有差异本研究对5种报道的引物运用牛分枝杆菌核酸以及人工模拟感染临床样本(肺脏、淋巴结和牛奶)敏感性检测，发现3号引物在核酸及人工模拟样本中敏感性较好，优于其他引物，但其特异性差。2号引物敏感性略逊于3号，但特异性最好。依据传统的流行病学、临床症状、病理变化或PPD试验初步诊断后，采用2号引物及其反应参数的病原PCR方法，适合临床牛结核病的快速准确诊断，其检测核酸的敏感性可达到0.1 fg，临床模拟样本可达10个菌/mL，因此具有良好的应用前景。此外，引物的退火温度是PCR反应参数的关键，运用生物学软件将引物评估后，然后设计从63 ℃至53 ℃的梯度温度降落PCR进行扩增，结果5对引物均在较为宽泛的退火温度得到有效扩增，因而为便于操作，统一了引物的退火温度。
3.3 特异性是PCR很重要的参数决定特异性因素包括待检菌基因是否特异、与其他菌种的同源性高低以及菌株之间的变异情况等[15]。本研究选择常见的牛组织及奶液中分枝杆菌属成员DNA：含牛分枝杆菌参考株、禽分枝杆菌C68202 (主要引起禽结核)、副结核分枝杆菌Ⅲ-Ⅴ (主要引起牛副结核)、结核分枝杆菌H37RV株(主要引起人结核)、胞内分枝杆菌等，以及牛奶中常污染的布鲁氏菌DNA，并以双蒸水作为阴性对照，PCR反应发现1、3、4号引物对分枝杆菌属成员均识别，而2、5号引物仅对牛分枝杆菌及禽结核分枝杆菌亚种识别，鉴于本研究主要针对牛结核病疑似样品进行诊断，而牛结核病一般由牛分枝杆菌或结核分枝杆菌引起，禽分枝杆菌一般认为对牛不致病。因此一旦疑似牛结核病料组织DNA中经PCR扩增出此特异性带，即可判定为牛结核病。
3.4 灵敏度是PCR检测另一重要参数1989年法国学者Hance等[16]首次运用PCR可检测1−100 fg纯化结核分枝杆菌DNA，阳性检出率明显高于常规细菌学方法[17]；2006年，刘思国等[18]建立的PCR可分别检出50 pg及250 fg牛分枝杆菌DNA；2016年，Zhang等[19]建立的牛分枝杆菌多重PCR灵敏度可以提高到15 pg DNA，特异性100%。本研究筛选出的2号引物(IS6110插入序列片段)对核酸的检测敏感性较高，达到0.1 fg。据报道，IS6110插入序列是结核分枝杆菌复合群的一个转座基因，在结核分枝杆菌复合群中存在不同数量的拷贝数[20]，而在分枝杆菌属其他菌种中不存在[21]。此外，即使是同一基因插入序列，不同片段引物其敏感性也有差异，如2号引物及5号引物。
3.5 PCR检测效果受反应条件、靶基因在基因组中的拷贝数等影响大在处理模拟样本时，面临的最大难点在于提取组织样品和奶样中分枝杆菌核酸。由于结核分枝杆菌壁厚，脂质含量高，破壁困难；再加上组织样本和奶样成分复杂，许多样品存在Taq DNA聚合酶抑制物，可能还有大量的非特异性DNA模板竞争扩增[5, 22]。因此，采取适当方法对临床标本进行处理，去除其中的杂质，使分枝杆菌DNA尽可能地释放出来，避免外源性核酸和扩增子的污染是很重要的环节。2016年，Fell等[23]用磁珠法提取牛和红鹿组织样本中的牛分枝杆菌进行PCR检测，取得了满意的效果。本试验同时采用常规方法和磁珠法分别进行核酸提取，在采用常规细菌组织基因组提取试剂盒提取核酸时，额外加入了40 mg/mL的溶菌酶，并进行37 ℃孵育2 h破壁；在提取奶样中核酸时，预先对乳液采用12 000 r/min离心1min，挑弃上层乳脂再进行试验，均取得较好效果。另外，采用基于磁珠法原理的商品化自动核酸萃取系统完成组织核酸提取也效果良好。
3.6 电泳胶“断带”现象原因分析在添加不同浓度菌液进行临床模拟样本PCR试验中，有时电泳胶会出现“断带”现象，即添加高浓度菌液样本无目的条带，而低浓度出现明显条带。经试验分析，这主要与分枝杆菌本身的特性有关，因为牛分枝杆菌菌落在固体培养基上呈颗粒、结节、花菜状，在液体培养基上易形成皱折状菌膜[14]，因而菌体容易在溶液或匀浆液中发生聚集和沉淀，在添加菌液和提取组织核酸时需注意不间断混匀。
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表1(Table 1)
