2020, Vol. 47扩展功能
文章信息
- 张科, 李臻, 郑瑶, 麻红星, 刘梦含, 丁慧杰, 王瑜, 刘丽, 夏西超
- ZHANG Ke, LI Zhen, ZHENG Yao, MA Hong-Xing, LIU Meng-Han, DING Hui-Jie, WANG Yu, LIU Li, XIA Xi-Chao
- 河南叶县岩盐可培养中度嗜盐菌的多样性
- Biodiversity of culturable moderate halophilic bacteria of rock salt in Yexian county, Henan province
- 微生物学通报, 2020, 47(12): 3987-3997
- Microbiology China, 2020, 47(12): 3987-3997
- DOI: 10.13344/j.microbiol.china.200478
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文章历史
- 收稿日期: 2020-05-15
- 接受日期: 2020-09-21
- 网络首发日期: 2020-09-25
2. 平顶山市药用微生物工程中心 河南 平顶山 467000;
3. 郑州大学人民医院 河南省人民医院微生物组实验室 河南 郑州 450003
2. Medical Microbiology Engineering Center in Pingdingshan, Pingdingshan, Henan 467000, China;
3. Microbiome Laboratory, Henan Provincial People's Hospital, People's Hospital of Zhengzhou University, Zhengzhou, Henan 450003, China
嗜盐微生物(halophiles)是一类生长于盐湖、盐碱土壤、晒盐场、盐矿以及高盐制品等富盐极端环境下的特殊微生物，它们通过在胞内积累高浓度的盐离子或者有机相容性溶质来适应富盐的极端环境，同时产生水解酶、多聚物、表面活性物质、光敏蛋白、色素和细胞毒素等多种生物活性物质，在可降解材料、生物燃料、酶制剂、制药领域等新型生物化工产业以及污染治理和污水处理等领域具有较强的应用价值和研究价值[1]。因此，嗜盐微生物逐渐成为科学家关注的焦点。在我国，科学家围绕新疆[2-3]、青海[4]、西藏[5]、内蒙[6]、陕西[7]、山西[8]等地的盐湖、盐碱土壤等富盐环境，以及沿海的海水、盐田[9-10]开展了大量的嗜盐微生物相关研究。这些研究表明嗜盐微生物广泛存在于各种富盐环境。
岩盐是陆地闭塞凹陷环境在强烈的干旱或蒸发作用下、海水或者湖水干涸、盐类物质逐渐沉积又在地质挤压等作用下逐渐形成的盐类岩石，是一种富盐环境[11]。然而目前国内外关于岩盐微生物的研究较少。2006年，田新朋等[12]从云南盐矿分离到Halorubrum、Natronococcus、Natrialba和Halalkalicoccus等4个属的嗜盐微生物。2006年，肖炜等[13]从昆明盐矿古老岩盐沉积物分离到厚壁菌门、变形菌门和放线菌门3个门44株细菌，其中7株可能是新种或者新属。2007年，陈义光等[14]从一平浪盐矿古老岩盐沉积物分离到4个门24个属的微生物，其中Y21菌株可能是Staphylococcaceae的一个新属。2011年，Gramain等在智利Salar Grande盐矿的盐芯中发现Halobacterium的微生物[15]。2013年，Xiao等[16]分析了云南盐矿的细菌和古菌物种多样性，发现不同地点盐矿样品物种多样性存在较大差异。2015年，Chen等[17]在云南盐矿发现了一个新物种Haloruburm yunnanense。2019年，陈礼楠等[18]从安徽定远盐矿盐芯样品中分离到嗜盐古菌150株、嗜盐细菌114株，发现产胞外蛋白酶菌株1株、酯酶1株、产淀粉酶2株、能液化明胶菌株2株。这些研究表明盐矿同样蕴含着丰富的嗜盐微生物，是研究嗜盐微生物的良好材料。
河南省西南部的平顶山市叶县，地处扬子至华北古板块碰撞诱发的舞阳凹陷盆地，独特的地质构造活动促使了盐岩沉积物的形成[19-20]。在叶县境内展布面积达400 km2，远景资源储量3 300亿t的岩盐，氯化钠平均含量为85%-95%，品位居全国井盐之首，为全国第二大内陆盐田，被誉为“中国岩盐之都”[21]。然而，该地岩盐嗜盐微生物相关的研究未见报道。本研究采用前言(1材料与方法前) Alkaline oligotrophic medium (AOM)、Neutral haloarchaeal medium (NHM)、Diluted modified marine agar (dmMA)和ISP3 medium (ISP3)这4种培养基，在5%和10%两种盐度下分离和纯化卤水和盐土中的嗜盐微生物，探讨叶县岩盐可培养中度嗜盐微生物的多样性，以期为开发和利用叶县岩盐微生物资源以及了解岩盐形成的生物因素提供参考。
1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 供试样品2018年9月-2019年6月，在河南省平顶山市叶县(33°62'N，113°35'E)采集卤水和盐土样本。用5个干净的10 L水桶装50 L卤水，在多个采样点用50 mL的离心管采集10管盐土带回平顶山学院药用微生物工程中心，立即处理。
1.1.2 培养基AOM和NHM是常见的用于嗜盐微生物分离和培养的培养基[22-23]；ISP系列培养基主要用于放线菌以及嗜盐放线菌的分离和培养，ISP3是其中的常用培养基[24]；另外，dmMA是寡营养培养基，有报道[25]使用寡营养培养基获得了3个潜在的新属和13个潜在的新种。因此选择了以上4种培养基，分别以10%和5%两个盐度来分离和纯化中度嗜盐细菌。(1) AOM培养基(g/L)[22-23]：酵母提取物0.05，鱼粉蛋白胨0.25，丙酮酸钠1.0，氯化钾5.4，氯化钙0.1，硝酸钠0.5，七水硫酸镁0.1，K2HPO4缓冲液2 mL，pH 9.0。使用0.1 mol/L的HCl调节pH至7.0。(2) NHM培养基(g/L)[22-23]：酵母提取物0.05，鱼粉蛋白胨0.25，丙酮酸钠1.0，氯化钾5.4，氯化钙0.29，氯化铵0.27，七水硫酸镁26.8，六水氯化镁23.0，K2HPO4缓冲液2 mL，pH 7.0。(3) ISP3培养基(1 L)[24]：燕麦20 g煮沸取滤液，硫酸亚铁1 mg，硫酸锌1 mg，氯化锰1 mg，维生素B1 0.5 mg，维生素B2 0.5 mg，维生素B6 0.05 mg，维生素E 1 mg，维生素C 5 mg。(4) dmMA培养基(g/L)[25]：胰蛋白胨0.5，酵母提取粉0.1，硫酸镁20.0，硫酸钠20.0。
以上为液体培养基，加入20 g/L的琼脂即为对应的固体培养基；K2HPO4缓冲液：取0.5 mol/L KH2PO4 30 mL，加0.5 mol/L K2HPO4 100 mL，混匀，用约2 mL 0.5 mol/L K2HPO4调节pH到7.5。由于采集的卤水是饱和的盐水，含盐约30%，因此分别使用稀释6倍(含盐约5%)、3倍(含盐约10%)的卤水配制以上固体培养基和液体培养基。
1.1.3 主要试剂和仪器2×Taq PCR Mix，天根生化科技(北京)有限公司。生化培养箱，上海智城分析仪器制造有限公司；PCR仪，Bio-Rad公司；水平电泳仪，北京六一生物科技有限公司。
1.2 样品预处理对于卤水，带回实验室的卤水立即使用0.22 μm滤膜过滤富集卤水中的微生物。使用无菌剪刀把富集过的滤膜绞碎，置于50 mL液体培养基中，28 ℃、120 r/min富集培养48-96 h。盐土预处理：称取10 g土壤，加入100 mL过滤后的高压灭菌过的卤水，混匀，取上清，即菌悬液。取2 mL菌悬液加入到50 mL液体培养基中，28 ℃、120 r/min富集培养48-96 h甚至更长时间，直至培养基浑浊。
1.3 菌株分离和保菌把富集培养的菌液进行10-1、10-2、10-3、10-4、10-5和10-6梯度稀释，分别取200 μL稀释菌液涂布到对应的固体培养基，28 ℃培养48-96 h，直到肉眼可见菌落。尽量挑取形态具有差异的菌落，如果形态类似就随机挑取多个菌落，在对应的固体培养基上做划线培养，直到获得单菌落，再做液体培养。以含30%甘油的对应液体培养基作为保菌液，取400 μL菌液，等比例加入保菌液，-80 ℃环境下保存。
1.4 细菌16S rRNA基因扩增与测序采用细菌通用引物27F (5′-AGAGTTTGAT CCTGGCTCAG-3′)和1492R (5′-TACGGCTACCTT GTTACGACTT-3′)对分离纯化的菌株进行鉴定。以稀释的菌液作为模板：用1 mL液体培养基进行梯度稀释，经灭菌的生理盐水作为稀释液，得到10-1、10-2、10-3共3种浓度的稀释菌液。PCR反应体系(30 μL)：2×Taq PCR Mix为15 μL，ddH2O为12.6 μL，引物27F (20 μmol/L) 0.2 μL，引物1492R (20 μmol/L) 0.2 μL，模板2 μL。PCR反应条件：95 ℃ 5 min；95 ℃ 50 s，53 ℃ 45 s，72 ℃ 120 s，34个循环；72 ℃ 10 min；4 ℃保存。采用1%的琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物，得到1 500 bp左右的条带，切下目的条带，送通用生物系统(安徽)有限公司和北京六合华大基因科技有限公司测序，选择两头测序、测通的测序方式。
1.5 细菌16S rRNA基因分析与初步鉴定对于测序返回的16S rRNA基因序列，导入原核生物在线分析软件EzBioCloud[26] (https://www.ezbiocloud.net/)初步判断分类地位。运用NCBI网站在线BLAST功能，比对获得其参考序列。两个数据库比对结果相悖的时候，在NCBI比对过程中参考序列注释到多个种的，以EzBioCloud比对结果为准。最后使用MEGA 5.0[27]，采用邻接(neighbor-joining，NJ)法[28]聚类分析和构建系统发育进化树。重复取样(bootstrap value) 1 000次，评估系统进化树的拓扑结构稳定性[29]。
2 结果与分析 2.1 河南叶县岩盐中度嗜盐菌的分离结果经过纯化培养和初步鉴定，一共获得了嗜盐菌株78株，分布在3个门7个属：变形菌门(Proteobacteria)的Sphingomonas 3株、Halomonas 5株；放线菌门(Actinobacteria)的Brevibacterium属3株；厚壁菌门(Firmicutes)的Bacillus 26株、Halobacillus 30株、Oceanobacillus 10株和Staphylococcus 1株，详见表 1。
| Phylum | Genus | Strains number | Total | |||
| NHM | AOM | ISP3 | dmMA | |||
| Firmicutes | Bacillus | 8 | 4 | 11 | 3 | 26 |
| Staphylococcus | 1 | 0 | 0 | 0 | 1 | |
| Oceanobacillus | 0 | 0 | 10 | 0 | 10 | |
| Halobacillus | 3 | 4 | 6 | 5 | 18 | |
| Actinobacteria | Brevibacterium | 0 | 3 | 0 | 0 | 3 |
| Proteobacteria | Sphingomonas | 0 | 3 | 0 | 0 | 3 |
| Halomonas | 6 | 5 | 3 | 3 | 17 | |
| Total | 7 | 18 | 19 | 30 | 11 | 78 |
ISP3培养基分离出来了最多的菌株，并且仅有该培养基分离到Oceanobacillus的细菌；仅有AOM培养基分离出来了Sphingomonas和Brevibacterium的细菌，并且与其他培养基相比，该培养基培养出来了最多5个属的细菌；dmMA培养基仅培养出来Halomonas、Halobacillus和Bacillus 3个属的细菌，而其他3种培养基也培养出来了这2个属的细菌，也就是说，在属水平上，dmMA培养基没有分离出来具有特色的菌属；另外，这4种培养基都培养出了不同数量的Halobacillus和Bacillus。
2.3 2个盐度的比较相同的是，盐度5%和10%纯化到的菌株数量一致，均为39株，并且在2个盐度下都纯化出Bacillus、Brevibacterium、Halobacillus和Sphingomonas的细菌，也就是说这4类菌属适应的盐度位于5%-10%附近，它们有着比较宽的盐度适应性。不同的是：仅从10%的盐度纯化到Halomonas和Oceanobacillus的细菌，即这两类菌属适应的盐度处于10%附近甚至更高；在5%的盐度下没有培养出来Halomonas和Oceanobacillus，培养出来1株Staphylococcus，即该菌属适应的盐度处于5%附近甚至更低。
2.4 2个样品的比较盐土和卤水中都分离到了Bacillus和Halobacillus，只是从盐土中分离到了更多的Halobacillus，从分离和纯化的结果来看，他们在卤水和盐土中具有较高丰度；仅在卤水中分离到了Oceanobacillus、Sphingomonas和Staphylococcus；仅在盐土里面分离到了Brevibacterium和Halomonas，详见表 2。
| Phylum | Genus | Strains number | Total | |||
| 5% Brine | 10% Brine | 5% Saline soil | 10% Saline soil | |||
| Firmicutes | Bacillus | 13 | 2 | 9 | 2 | 26 |
| Oceanobacillus | 0 | 10 | 0 | 0 | 10 | |
| Staphylococcus | 1 | 0 | 0 | 0 | 1 | |
| Halobacillus | 0 | 4 | 0 | 14 | 18 | |
| Actinobacteria | Sphingomonas | 2 | 1 | 0 | 0 | 3 |
| Proteobacteria | Halomonas | 0 | 0 | 13 | 4 | 17 |
| Brevibacterium | 0 | 0 | 1 | 2 | 3 | |
| Total | 16 | 17 | 23 | 22 | 78 | |
菌株的16S rRNA基因序列登录号已经上传GenBank，登录号见表 3。把测序菌株的16S rRNA基因序列导入EzBioCloud在线分析软件进行初步判断；再在NCBI做BLAST比对，把相似度最高的序列一条作为参考序列(表 3)，相似度在99%-100%。然后使用MEGA 5.0软件(NJ法)构建系统发育树，见图 1。
| Phylum | Genus | Strain | Accession No. (GenBank) |
Reference accession No. (GenBank) |
Similarity (%) |
Reference species |
| Firmicutes | Bacillus | MD1, etc. 6 strains | MT433867 | MT120178.1 | 99.44 | Bacillus zanthoxyli |
| Bacillus | MI7 | MT433865 | MT120178.1 | 99.30 | Bacillus zanthoxyli | |
| Bacillus | ZI5, ZI8 | MT433860 | KT922010.1 | 100 | Bacillus aquimaris | |
| Bacillus | DY3, etc. 5 strains | MT433877 | KT922010.1 | 100 | Bacillus aquimaris | |
| Bacillus | DN6, etc. 4 strains | MT433879 | MT103052.1 | 100 | Bacillus oceanisediminis | |
| Bacillus | DA5 | MT433882 | MT211515.1 | 100 | Bacillus tequilensis | |
| Bacillus | DA14, etc. 3 strains | MT433880 | KR708834.1 | 99.06 | Bacillus velezensis | |
| Bacillus | LI2, LI12 | MT433873 | MH144238.1 | 100 | Bacillus marisflavi | |
| Oceanobacillus | ZI6, etc. 10 strains | MT433859 | MT110647.1 | 100 | Oceanobacillus picturae | |
| Staphylococcus | DN8 | MT433878 | KT260365.1 | 100 | Staphylococcus sciuri | |
| Halobacillus | LN6 | MT433871 | FJ444973.1 | 99.93 | Halobacillus trueperi | |
| Halobacillus | ZN3, ZN24 | MT433858 | KJ563233.1 | 99.01 | Halobacillus marinus | |
| Halobacillus | ZD31 | MT433861 | KJ563233.1 | 100 | Halobacillus marinus | |
| Halobacillus | ZD21 | MT433862 | KJ563233.1 | 99.58 | Halobacillus marinus | |
| Halobacillus | LD2, etc. 12 strains | MT433874 | KJ563233.1 | 100 | Halobacillus marinus | |
| Proteobacteria | Sphingomonas | ZA10 | MT433863 | MT043729.1 | 99.40 | Sphingomonas melonis |
| Sphingomonas | DA7, DA9 | MT433881 | MK318593.1 | 99.85 | Sphingomonas melonis | |
| Halomonas | MA20, MA22 | MT433869 | KP706816.1 | 99.49 | Halomonas huangheensis | |
| Halomonas | MI16 | MT433864 | MN166176.1 | 99.03 | Halomonas meridiana | |
| Halomonas | LN8 | MT433870 | MN166176.1 | 99.50 | Halomonas meridiana | |
| Halomonas | MD10 | MT433866 | GQ903441.1 | 99.84 | Halomonas ventosae | |
| Halomonas | LA1, LA9 | MT433876 | MH725332.1 | 100 | Halomonas aquamarina | |
| Halomonas | LI16 | MT433872 | JQ799096.1 | 99.79 | Halomonas boliviensis | |
| Actinobacteria | Brevibacterium | MA25 | MT433868 | KF424671.1 | 99.58 | Brevibacterium iodinum |
| Brevibacterium | LA3, LA14 | MT433875 | KM507608.2 | 99.98 | Brevibacterium sediminis |
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| 图 1 河南叶县岩盐可培养中度嗜盐菌基于细菌16SrRNA基因的NJ系统发育树 Figure 1 Phylogenetic NJ tree of culturable moderate halophilic bacteria isolated from rock salt from Yexian county in Henan of based on 16S rRNA gene 注:括号中是16S rRNA基因的GenBank登录号; 竖线后表示属，门分类阶元; 节点上的数字表示Bootstrap值; ●: Baillus分离株; ■: Staphylococcus分离株; ▲: Oceanbaillus分离株; ▼: Halobacillus分离株; ○: Brevibacterium分离株; ◆ : Sphingomonas分离株; □: Halomonas分离株. Note: GenBank accession number of 16S rRNA gene were given in the parentheses; The taxon of genus and phylum were given after the vertical line; The numbers at the branch point represented the bootstrap value; ●: Bacillus isolates; ■: Staphylococcus isolates; ▲: Oceanbacillus isolates; ▼: Halobacillus isolates; ○: Brevibacterium isolates; ◆: Sphingomonas isolates; □: Halomonas isolates. |
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我国有着盐湖、盐碱地、晒盐场以及盐岩矿等丰富多样的富盐极端环境，这些富盐环境为开展嗜盐微生物的研究提供了极佳的研究材料。河南叶县(石膏型卤水)因岩盐品味居全国之首，被誉为“中国岩盐之都”。然而，其相关微生物的研究未见报道。为了开发和利用岩盐嗜盐微生物资源，采用AOM、NHM、dmMA和ISP3四种培养基分别在5%和10%两种盐度下，初步探讨了河南叶县岩盐的卤水和盐土中可培养中度嗜盐菌的多样性。分离到的78株细菌归类于厚壁菌门、变形菌门和放线菌门，这与陈义光等[14]对一平浪盐矿(硫酸钠型卤水)古老岩盐沉积物的研究、肖炜等[13]对昆明盐矿古老岩盐沉积物的研究一致，甚至与沈硕[30]对青藏高原察尔汗盐湖地区可培养中度嗜盐菌的研究也一致，表明地下盐矿以及地表盐湖的微生物类群在门水平上存在一定的一致性。
差异主要表现在属水平。我们分离到了葡萄球菌(Staphylococcus)、短杆菌属(Brevibacterium)和鞘氨醇单胞菌属(Sphingomonas)的成员，这些微生物在岩盐微生物相关研究中还未见报道。短杆菌属(Brevibacterium)是海洋放线菌目中的稀有菌属之一，存在于热泉[31]、深海海泥[32]、海洋沉积物[33]等多种环境。唐树戈等[34]在滨海湿地分离到短杆菌属的菌株，并且发现它们具有耐盐和耐碱的特性。在盐湖、晒盐场等富盐环境下存在丰富的放线菌资源[2]，但是在岩盐矿中很少分离到短杆菌(Brevibacterium)。鞘氨醇单胞菌属(Sphingomonas)广泛分布于水体、土壤、空气以及极端环境[35]，甚至昆虫肠道[36]，我们在岩盐矿中也分离到该属细菌。鞘氨醇单胞菌属(Sphingomonas)可以耐受极端营养贫瘠，可以利用各种简单分子，还可以降解复杂有机物例如芳香类化合物等，该属的部分种还可以合成结冷胶和β-胡萝卜素等，具有良好的应用价值。短杆菌属和鞘氨醇单胞菌属分离株的生理特性是我们下一步研究的重点。葡萄球菌是临床上常见的病原菌，因基因变异导致耐药而著称。在舟山的海泥[37]、青藏高原的盐湖[30]以及豫东的盐碱地[38]等环境中都分离出葡萄球菌，它们对盐具有一定的耐受性。葡萄球菌(Staphylococcus)、短杆菌属(Brevibacterium)和鞘氨醇单胞菌属(Sphingomonas)的发现表明了叶县岩盐蕴含着独特的微生物资源。
我们还分离到了Halobacillus、Bacillus、Oceanobacillus和Halomonas等4个属的细菌，这些细菌是晒盐场、盐湖以及盐矿等富盐环境常见的微生物类群。沈硕[30]采用8种培养基在28 ℃和37 ℃分离和培养了青藏高原察尔汗盐湖的中度嗜盐菌，Bacillus、Oceanobacillus和Halomonas具有较高丰度。我们也分离到了多个Halomonas类群，并且Bacillus在分离到的菌属中占有较高丰度。与陈礼楠等[18]对安徽定远盐矿盐土和卤水、田新朋等[12]对云南黑井古盐矿的盐土、陈义光等[14]对一平浪盐矿沉积物以及肖炜等[13]对昆明盐矿沉积物的研究相比较，大量的嗜盐古菌和嗜盐细菌如Halospina、Pseudomonas等菌属在本研究中并未发现。我们的结果与沈硕对盐湖的研究[30]类似而与肖炜等对盐矿的研究[12-14, 18]迥异的原因，可能是嗜盐古菌和极端嗜盐的细菌需要20%-25%的盐度，甚至是饱和的盐水[39]，而我们采用的是5%和10%的盐度。
另外，在培养基方面：AOM和NHM是常用的嗜盐微生物分离培养中使用的培养基[22-23]，本研究发现，在4种培养基分离到的3个门7个属的微生物中，这2种培养基分离到了3个门6个属的微生物，也就是说，这两种培养基具有良好的覆盖度，这一发现为后续岩盐微生物的分离与鉴定提供了培养基的支持。ISP系列的培养基主要用于土壤、高盐环境、植物内生放线菌的分离与鉴定[24]。本研究中，使用ISP3培养基没有更好的发现，甚至没有分离到放线菌，然而仅有该培养基分离到了Oceanobacillus的微生物；虽然报道称dmMA可以分离到许多新的种甚至属[25]，但是我们的研究发现，该培养基仅仅分离到了Halomonas、Bacillus和Halobacillus 3个属的微生物；ISP3和dmMA没有表现出文献报道的结果，可能跟我们使用的盐度(中度，5%和10%)有关，在更高盐度(> 25%)的情况下，ISP3和dmMA可能会分离到更为特殊的微生物。
本文采用传统分离和培养的方法揭示了河南叶县岩盐中度嗜盐菌的多样性，发现该地与盐湖、盐碱地、晒盐场以及盐岩矿等富盐极端环境的微生物相比存在较大的差异，并且获得了宝贵的岩盐微生物资源，为进一步研究岩盐微生物在复杂高盐环境下的代谢特征、生物学适应机制和酶制剂开发，以及探索岩盐形成中的生物学过程提供了理想的研究材料。当然，为了进一步了解叶县岩盐微生物的多样性，除了采用更高盐度的培养基从盐芯、盐结晶里面分离和培养嗜盐古菌和极端嗜盐细菌之外，我们正在采用高通量测序的技术深入研究。
致谢: 感谢云南省微生物研究所的唐蜀昆老师、江苏大学的崔恒林老师和山东大学的穆大帅老师在培养基方面给予的帮助。| [1] |
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