沙眼衣原体(Chlamydia trachomatis，Ct)是女性生殖道(female genital tract，FGT)感染性疾病最常见的性病病原体，专性寄生于黏膜上皮细胞^[1]。由于其感染的隐匿性，常常造成机体持续感染^[2]，引起不孕不育等严重并发症^[3-4]。Ct感染还可增加艾滋病病毒(human immunodeficiency virus，HIV)感染率及宫颈癌和卵巢癌的发病率^[5-7]，其所引起的生殖道感染已成为除艾滋病外耗资最大的性传播疾病。多年研究表明，接种疫苗是预防Ct感染最行之有效的措施^{[2, 8-9]}。随着生物信息学、蛋白质组学和基因组学等快速发展，特别是Ct完整基因组序列的获得，大大地促进了Ct候选疫苗的研制^[10]。亚单位疫苗、DNA疫苗和树突状细胞疫苗等技术不断发展，给Ct疫苗的发展提供了很多思路，然而它们都没有成功地应用于临床^{[2, 11]}。这可能与疫苗研制的着重点有关，研究者在构建疫苗时往往侧重于如何增强Ct抗原所诱导血液中的抗体和特异性T细胞反应强度，尽管血液中存在高浓度的抗体和特异性T细胞，它们却无法在感染早期快速清除Ct。

近期，研究者们陆续发现增强黏膜免疫更适合控制Ct感染^{[9, 12-13]}，增强粘膜免疫成为抵抗沙眼衣原体生殖道感染的新策略。生殖道黏膜免疫系统作为防御Ct感染的第一道防线，既存在体液免疫和细胞免疫，又驻留了一些特殊的免疫细胞^[14-16]。如果能增强其黏膜免疫效能，在感染早期提供强有力的保护，阻断Ct定殖，便能有效地防御Ct感染和传播。本文旨在阐述黏膜免疫在FGT Ct感染中的作用和在Ct疫苗研制中的应用现状，并归纳了一些增强Ct疫苗诱导黏膜免疫的策略。

Ct感染的主要黏膜病理改变过程为慢性炎症，造成输卵管损伤和瘢痕形成，引起并发症，其中炎症细胞因子在疾病发生发展的过程中起了很大作用。Ct与靶细胞第一次接触时就会释放出大量的TNF-α、IL-1、IL-8和GM-CSF等，从而造成子宫附件损伤^[17]。Agrawal等发现从Ct感染的FGT分离出的宫颈细胞经过体外培养后，会分泌大量的IL-1、IL-6、IL-8和IL-10，这些细胞因子预示着疾病恶化^[18]。TNF-α由Ct特异性CD8⁺T细胞产生，会导致上生殖道病变^[19]；IL-1能直接损伤女性输卵管上皮细胞^[20]；高浓度的IFN-γ或者IL-10与女性不孕相关^[21-22]；IL-17与FGT炎症级联反应有关^[23]。Ct经典致病因子热休克蛋白60 (heat-shock protein 60，HSP60)也是通过产生异常的细胞因子导致机体处于慢性炎症状态，引起盆腔炎和输卵管炎^[24-25]。HSP-60还能激活细胞毒性T淋巴细胞(cytotoxic T lymphocyte，CTL)，从而破坏宿主细胞和诱导迟发型变态反应^[24]。

Ct为了确保自身生存和繁殖充分利用本身和宿主细胞的蛋白、脂类和核酸等物质在下生殖道上皮细胞内建立感染，然后通过上行感染途径感染至上生殖道，造成不孕不育等严重疾病。Ct原体(elementary body，EB)通过性交进入FGT (图 1)，首先黏附于由杯状细胞分泌的黏液组成的黏液层，黏液层含有多种可以产生吲哚的微生物，Ct (D-K型血清型)作为一种色氨酸营养缺陷体，能从生殖道正常微生物群中获取吲哚，再利用色氨酸合成酶TrpBA将吲哚转化为色氨酸，促进Ct感染存活^[26]。穿过黏液层后，Ct需要粘附于上皮细胞来诱导主动吞入EB，并在细胞内形成包涵体便于Ct发育和繁殖。大多研究表明Ct主要通过脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)、主要外膜蛋白(major outer membrane protein，MOMP)和多形态膜蛋白(polymorphic membrane proteins，Pmps)等多种粘附蛋白与黏膜上皮细胞表面的硫酸乙酰肝素蛋白聚糖、甘露糖受体和表皮生长因子受体结合^[27-28]，再利用Ⅲ型分泌系统(the type Ⅲ secretion system，T3SS)效应蛋白诱导细胞骨架重排，促进Ct入侵并形成包涵体^{[27, 29]}。为了保持靶细胞的完整性以完成Ct在细胞内的发育周期，Ct通过抑制caspase8活化等途径来阻止宿主细胞发生凋亡，并以包涵体形式再通过表面蛋白和转运体从宿主细胞高尔基体、线粒体和溶酶体中获取营养物质和能量，促进包涵体内的网状体(reticulate body，RB)复制^[30]。Ct在生殖道压力(抗生素的使用，铁缺乏或者合并感染等)的作用下会进入隐匿感染状态，RBs改变HSP60、外膜蛋白和LPS的表达量，转化为异型小体(aberrant body，AB)以逃避宿主抗感染免疫反应，引发Ct持续感染^{[25, 31]}；当外界压力减弱或者消失时，ABs又可以恢复为活跃状态的RBs，RBs再转化为感染型EBs并从靶细胞中释放，这种释放机制与Ct蛋白酶样活性因子(chlamydial protease-like activity factor，CPAF)等的酶解作用有关^[32]。释放出的子代EB逐渐移行感染至子宫和输卵管上皮细胞，引起盆腔炎和输卵管损伤，还能进入黏膜下层侵犯免疫细胞，干扰细胞信号转导途径，释放出异常炎症因子，引起FGT异常的炎症反应，最终导致不孕不育等疾病^[3]。

图 1　女性生殖道Ct感染和致病途径 Figure 1　The infection and pathogenesis of Ct in female genital tract 注：Ct通过性传播途径进入女性下生殖道，首先必须与黏液层的多种抗菌物质和正常微生物群相互作用，才能穿过黏液进入上皮层.大部分Ct侵犯上皮细胞，通过：① EB粘附与入侵宿主细胞；②形成包涵体；③ EB转化为RB；④ RB复制；⑤ RB转化为AB或AB再活化；⑥ RB转化为子代EB；⑦子代EB释放出来继续感染邻近上皮细胞，经上行感染造成生殖道病变，少部分可以通过上皮层的裂缝或者释放出的子代Ct进入固有层，入侵免疫细胞，诱导异常炎症因子产生，引发损伤. Note: Ct has to interact with a variety of antimicrobial substances and normal microbiota in the mucus layer before it can pass through the mucus and enter the epidermis when it enters the female lower reproductive tract through sexual transmission. Then Ct invades epithelial cells and finishes its life cycle (① Extracellular EB binds to and invades host cells; ② Establishing an intracellular niche; ③ Transition of elementary to reticulate body; ④ Replication; ⑤ Transition of reticulate body to aberrant body and reactivation; ⑥ Transition of reticulate to elementary body; ⑦ Exiting the host cell), and their offspring continue to infect adjacent epithelial cells, make genital tract lesions by ascending infection; a few can enter lamina propria by cracks in the epidermis or released from the host cells, then they mainly infect immune cells and induce abnormal inflammatory cytokines to cause damage.

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Ct感染FGT后激活黏膜免疫系统，刺激弥散免疫细胞和黏膜相关淋巴组织产生免疫分子(以IFN-γ为主)来抵抗Ct感染(图 2)。女性上/下生殖道黏膜分别由柱状上皮和复层鳞状上皮细胞覆盖，在先天性和适应性免疫反应中具有不同的保护机制^[15]。Ct进入FGT后，首先遇到的屏障为黏液层，FGT黏液的厚度、pH值和成分会随着月经周期的不同而变化，这些变化也会影响Ct的易感性^[33]。穿过黏液层后，Ct可以利用自身的外膜蛋白、肽聚糖和质粒编码基因分别与上皮细胞的Toll样受体、核苷酸结合寡聚化结构域样受体和胞质传感器STING结合，使细胞发生主动免疫反应^[27]；另外，Ct也可以通过上皮屏障的裂口进入黏膜下层，并利用病原体相关分子模式与FGT黏膜固有免疫细胞模式识别受体结合，释放出多种细胞因子，激活宿主体液和细胞免疫^[20]。值得注意的是，中性粒细胞还能在机体初次感染12 h内接收到上皮细胞发出的感染信号^[34]，通过变形从外周血大规模地迁移至感染部位，随后直接吞噬病原体、形成中性粒细胞胞外诱捕网再释放富含蛋白酶的颗粒和活性氧物质^[35]或者辅助抗体发挥中和作用^[36]来清除Ct。体液免疫主要是B细胞产生的IgG和分泌型IgA (secretory IgA，sIgA)主导的，这些抗体也能被转运到感染部位并停留于黏液层^[20]。同时CD4⁺Th1细胞会进入防御状态，释放以IFN-γ为主的细胞因子，抵御Ct感染^[21]；其他的活化CD4⁺Th2和Th17细胞能够产生IL-13和IL-17，辅助Th1细胞抵抗Ct^[31]。CD8⁺T细胞活化后形成的CTL能够诱导Ct感染细胞发生细胞凋亡，阻碍Ct生长^[20]。最新研究显示，FGT黏膜组织还驻留着一些特殊的免疫细胞，它们在抵抗Ct感染时具有很大的潜能，能在感染早期发挥有效的灭菌免疫，逐渐成为衣原体的研究热点^{[29, 35, 37-38]}。

图 2　女性生殖道抗Ct感染的黏膜免疫保护机制 Figure 2　The mucosal immunity against Ct infection in female genital tract 注：生殖道黏液与阴道微生物菌群(主要为乳酸杆菌)维持着生殖道黏膜的稳态.当EB通过性交进入生殖道，与黏液层阴道微生物菌群、多种抗菌微粒和抗体相互作用后入侵上皮层，感染上皮细胞，释放出感染信号，固有免疫细胞(中性粒细胞、树突状细胞和单核-巨噬细胞等)接收到信号，释放出细胞因子，招募固有层免疫细胞参与反应.生殖道黏膜CD4+和CD8+T细胞通过各种免疫保护机制抵抗Ct感染；B细胞分化为浆细胞，浆细胞通过分泌IgG、IgA和IgM抵抗Ct感染.另外，FGT还驻留一些特殊的免疫细胞，CD4+和CD8+TRM细胞在Ct入侵的第一时间可快速产生IFN-γ清除Ct；ILCs也能释放细胞因子增强子宫防御功能；巨噬细胞和B细胞参与淋巴滤泡的形成，可能参与抗原呈递并分泌多种细胞因子和抗体(nAb/bnAb)；而TReg主要负性调节其他免疫细胞，维持免疫系统的稳态. Note: The genital tract mucosa maintains homeostasis with the vaginal microbiome, comprising primarily Lactobacillus. When the EB enters into the reproductive tract through sexual intercourse, and fights with antibacterial particles, antibodies and vaginal mucous layer microbial flora, then they infect epithelial cells and release signals to make innate immune cells (neutrophils, dendritic cells and monocyte-macrophages) to release cytokines that recruiting lamina propria immune cells. In female genital tract mucosa, CD4+ and CD8+T cells provide various immune protections against Ct infection; B cells differentiate into plasma cells, which resist Ct by secreting IgG, IgA and IgM. More strikingly, a number of special immune cells reside in female genital tract mucosa, CD4+ and CD8+TRM can rapidly generate IFN-γ once Ct invades; ILCs also release cytokines that enhance uterine defense. Macrophages and B cells are involved in the formation of lymphoid follicles and may be involved in antigen presentation and secrete a variety of cytokines and antibodies (nAb/bnAb); however TReg cells mainly negatively regulate others and maintain the homeostasis of the immune system.

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组织常驻记忆T细胞(tissue resident memory T cell，TRM)是近期发现的一种T细胞谱系，驻留于局部组织，不参与血液和淋巴循环^[39]，对局部Ct感染具有高效的清除作用。TRM细胞来源于血液中的效应T细胞，通过调节KLF2、鞘氨醇-1-磷酸酯受体1、CD69和CCR7的表达长期驻留于组织中^[40]。FGT CD8⁺TRM细胞表达CD103，与上皮细胞表达的E型钙黏素结合驻留于上皮层，而CD4⁺TRM细胞不表达CD103，停留在阴道固有层^[39]，由于其优越的地理位置，TRM细胞能够第一时间接触入侵的Ct并清除感染。Johnson等^[16]对TRM细胞在Ct感染中的作用进行了系统性的总结，认为TRM细胞在Ct感染的过程中能提供快速有效的保护，但似乎只能通过黏膜免疫接种途径和黏膜佐剂才能诱导FGT产生TRM细胞。Stary等^[12]研制出一种新型疫苗——紫外线灭活Ct结合电荷交换粒子合成佐剂，这种疫苗能诱导出系统记忆性T细胞，但仅通过黏膜免疫接种时才产生TRM细胞，TRM细胞在无Ct抗原存在的情况下至少能存活6个月。当Ct再次感染机体时，上皮层CD8⁺TRM以最快的速度合成并分泌颗粒酶B和IFN-γ，固有层CD4⁺TRM细胞快速产生IFN-γ和IL-13^{[15, 38]}，在最短时间内破坏感染细胞并招募其他免疫细胞抵抗Ct感染。

黏膜组织体液免疫主要由B细胞产生的IgG和sIgA组成，而且受激素的影响，FGT B细胞分泌的IgG含量大于sIgA^[15]，sIgA参与抗体依赖细胞介导的吞噬作用或者细胞毒性作用，IgG通过激活补体或者与巨噬细胞和自然杀伤细胞(natural killer cell，NK)表达的FcRs结合诱导机体免疫反应消灭病原体^[14]。近期研究表明，FGT黏膜组织存在一种与循环B细胞功能相似但能常驻于组织的B细胞，能在病原体感染早期提供比循环B细胞更有效的保护^[16]。组织常驻B细胞似乎存在于Ct感染人类生殖道所诱导的具有选择性记忆淋巴细胞滤泡中^[16]，其寿命长达10个月^[14]，能较为长期地控制继发性Ct感染。组织常驻B细胞分泌的IgG和sIgA还能分别与FGT上皮细胞表达的新生儿Fc受体和多聚免疫球蛋白受体结合而聚集在上皮层或者转运至黏液层，能够抵抗高浓度病原体入侵黏膜组织^[41]。另外，由B细胞分泌的nAbs能在Ct入侵靶细胞之前破坏Ct抗原，阻止该病原体粘附靶细胞受体^[42]，并在组织受损伤轻微的情况下激活补体清除Ct，为机体提供杀菌效应^{[2, 14]}。Bulir等^[43]使用T3SS抗原通过滴鼻免疫接种小鼠，能在血清中产生高浓度中和抗体(neutralizing antibody，nAb)，尽管只有部分血清nAbs被运送到FGT中，但仍能有效地清除CM感染和预防输卵管病变。Bøje等^[44]应用多亚单位疫苗通过阴道接种哥根廷小型猪，这种新型疫苗诱导机体产生TH1细胞和中和抗体，抵抗Ct血清型D和F并建立长期保护。近几年还出现一种广谱中和抗体(broadly neutralizing antibody，bnAb)，这种抗体几乎能消灭每一个病原体变种^[45-46]。因此，如果能诱导组织常驻B细胞的合成和分泌nAbs/bnAb，便能在第一时间抵抗不同血清型Ct感染。

调节T细胞(regulatory T，T_Reg)是一类负性调节机体免疫反应的T细胞亚群，常驻于黏膜组织，可分为自然T_Reg和适应性T_Reg，能与靶细胞直接接触或者分泌TGF-β和IL-10来维持机体免疫系统的稳态^[47]。Marks等研究通过比较已感染和未感染Ct的C57BL/6小鼠上下生殖道中T_Reg分子标记物FoxP3 mRNA的表达量，结果显示上生殖道FoxP3 mRNA的增长量是下生殖道的6倍，并且在感染Ct后的第10天其表达量就开始增长^[48]。这个结果与我们之前的研究相吻合，由于具有免疫抑制功能的T_Reg主要存在于上生殖道，我们发现只有通过下生殖道接种提供的保护性免疫才能完全清除Ct^[49]。然而，最新研究表明CM感染颠覆了CD4⁺CD25⁺ FoxP3⁺T_Reg的免疫抑制功能，其分泌的TGF-β能促进Th17细胞分化和成熟，而对Th1细胞丧失了调控能力，机体内T_Reg的含量与CM感染诱导的输卵管病变程度成正相关^[50]。目前关于T_Reg与FGT衣原体感染的研究仍处于初级阶段，其具体的抗衣原体感染的免疫调节机制还有待研究。

天然淋巴细胞(innate lymphoid cells，ILCs)常驻于黏膜组织中^[15]，起源于普通淋巴祖细胞，但缺乏T、B细胞抗原受体，在病原体的刺激下可以快速活化参与免疫应答^[37]。ILCs分为杀伤性和辅助性两类细胞，杀伤性ILCs主要为NK细胞，可以释放颗粒酶、穿孔素和IFN-γ对Ct感染发挥免疫抵抗作用^[51]；辅助性ILCs根据其特征性的表面标志分为ILC1、ILC2和ILC3，其中ILC1和ILC3均可以分泌IFN-γ^[52]，另外ILC3还能表达IL-22，IL-22可以协助上皮细胞产生抗菌肽^[53]，ILC2与Th2相似，主要分泌IL-5和IL-13^[52]，这些细胞因子或肽类在病原体感染初期就会被释放出来参与免疫应答^[37]。然而当ILCs异常时也会加重机体的炎症反应，引发特异性皮炎、炎症性肠病和牛皮癣等^[54]。虽然目前关于ILCs与衣原体感染的研究很少，但是ILCs在黏膜组织中抗病原体感染的免疫反应和修复组织损伤的作用不容忽视。

Ct独特的双相发育周期和拥有多种血清型是其疫苗研发的主要阻碍^{[20, 25]}，在其生长繁殖过程中，Ct可以在EB、RB和AB三种存在形式间相互转化；另外Ct有15种血清型，不同血清型其致病机制存在差异。因此，Ct利用其不同状态下的存在形式和血清型进化出多种机制以逃避宿主的免疫清除作用，从而制约了人们对Ct疫苗的研制。

自1950年以来，Ct疫苗的研制在候选抗原、动物模型、免疫途径、佐剂和传送系统这些方面都在不断地创新，但都未能达到理想的结果^{[8, 21]}。然而Ct黏膜免疫疫苗的研制和发展充满前景，它们主要是通过黏膜免疫接种途径和黏膜佐剂激活机体黏膜免疫和系统免疫来清除和控制Ct感染；再加上共同黏膜免疫系统的存在，使黏膜免疫活化的淋巴细胞归巢到黏膜效应部位，打破了接种方式的局限性^[55-57]。Wang等^[58]研究表明胃肠道CM是非致病的菌株，通过口服接种胃肠道CM疫苗能在生殖道感染部位引起CD4⁺T细胞和B细胞的协同作用，而且不会产生任何有意义的病理损害。类似的研究也表明胃肠道CM能在气道中诱导以Th1细胞为主的黏膜免疫效应，预防同类型衣原体的再感染^[55]。Olsen等^[59]研究表明滴鼻免疫接种Hirep1疫苗促使Hirep1在生殖道产生中和抗体和CD4⁺T细胞。以上研究均表明胃肠道和鼻内免疫接种衣原体可使生殖道产生对衣原体的免疫保护作用。

从近几年的文献中我们归纳出2条针对解决Ct疫苗发展阻碍的方案(图 3)。如果能够利用现代生物学技术和逆向疫苗学寻找到中和EB外膜蛋白的抗原表位，设计出减毒活疫苗或多亚单位疫苗，结合黏膜佐剂，通过易于接受的黏膜免疫接种途径在局部黏膜组织分别产生超高滴度的nAbs和bnAbs，抵抗任何Ct血清型的感染；还可以利用多个保守的T细胞表位，通过“Prime-pull”策略能使黏膜免疫疫苗在局部黏膜组织诱导CD4⁺和CD8⁺TRM，产生强大的灭菌免疫，预防Ct感染。因此，一个真正可用于临床的疫苗需要在黏膜组织中诱导高浓度的TRM细胞、nAbs和bnAbs，切断Ct入侵途径，保护其他细胞或器官免受Ct感染。

图 3　Ct疫苗发展的阻碍和潜在的策略 Figure 3　The obstacles of development and potential strategies in Ct vaccine

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FGT黏膜免疫系统由黏膜上皮和广泛存在于固有层的免疫细胞组成，是宿主接触并摄取抗原和最初产生免疫应答的场所，其免疫状态是决定Ct是否成功感染宿主细胞的关键。在未来，如果能够将Ct疫苗研制的侧重点转移至黏膜免疫，设计出新型黏膜免疫疫苗，诱导机体在生殖道产生大量TRM细胞和分泌nAbs/bnAbs的组织常驻B细胞，从而增强生殖道黏膜组织的免疫防御功能，阻碍Ct定殖，有效地抵抗Ct感染。另外，随着单细胞RNA测序、质谱流式细胞术和逆向疫苗学的发展，将会大大促进我们对生殖道黏膜组织免疫细胞的理解，为寻找理想的Ct疫苗靶抗原奠定基础。