细菌致病作用与毒力岛(pathogenicity island，PAI)基因编码的效应蛋白(effector proteins，EP)密切相关，EP进入上皮细胞使得细菌黏附并促使其长时间定殖从而引起感染致病^[1]。许多革兰氏阴性菌Ⅲ型分泌系统(type Ⅲ secretion system，T3SS)是细菌与宿主细胞相互作用的基础，如沙门氏菌、志贺杆菌利用T3SS效应蛋白粘附或入侵宿主细胞^[2-3]；假结核耶尔森菌和小肠结肠炎耶尔森菌可通过T3SS效应蛋白诱导巨噬细胞的凋亡，进而破坏宿主的先天性免疫防线^[4]；肠致病性大肠杆菌(EPEC)和肠出血性大肠杆菌(Enterohemorrhagic Escherichia coli，EHEC)的T3SS效应蛋白会导致细菌黏附部位处细胞骨架的重排和肌动蛋白聚集形成踏板结构，被称为黏附及擦拭性损伤(Attaching and effacing lesions，A/E Lesions)^[5]。沙门氏菌作为第一个被发现拥有两套T3SS型分泌系统，分别为由SPI1编码的T3SS1和由SPI2编码的T3SS2，其中，T3SS1与侵袭力相关，T3SS2与全身性感染相关。SPI1在肠道沙门菌和邦戈尔沙门菌中均存在，而SPI2仅存在于肠道沙门菌中^[6]。相继地，研究者在分析E. coli O157:H7、EDL933和Sakai菌株的基因组序列时，发现了一种新的Ⅲ型分泌系统，为了区别于众所周知的ETT1肠细胞脱落位点LEE毒力岛编码的Ⅲ型分泌系统，将其命名为大肠杆菌Ⅲ型分泌系统2 (E. coli type Ⅲ secretion system 2，ETT2)毒力岛^[7]。

致病性大肠杆菌具有广泛的宿主谱，同时其血清型和毒力因子复杂多变，不仅是严重危害养禽业健康发展的重要病原菌，而且是人兽共患病的潜在病原体，其防治仍是当今世界性的难题^[8]。目前，对于致病性大肠杆菌ETT1功能相关的研究报道已有很多，而对于新发现的ETT2的功能以及它在病原菌毒力功能中的作用却知之甚少。本文主要对大肠杆菌ETT2的基因特征、ETT2的流行分布、ETT2的毒力相关功能等方面的研究进展进行概述。

ETT1是一种独立的多成分分泌系统，由20多种蛋白组成，30-40 kb编码，以毒力岛的形式存在于细菌的质粒或染色体上^[9]，T3SS具有较强的蛋白分泌能力，其针状结构可直接将分泌蛋白注入宿主细胞内以发挥致病作用；ETT2作为主要毒力基因簇，位于细菌染色体上的tRNA基因座glyU附近(图 1)，大小约29.9 kb，编码至少35个开放性阅读框，包括yqe (ecs3703-3706)、yge (ecs3707-3712)、epr (ecs3716-3719)、etr (ecs3720)、epa (ecs3721-3726)、eiv (ecs3727-3734)等，与鼠伤寒沙门氏菌致病性岛的几个序列类似^[10]；ETT2序列中G+C% (36.9%)相比大肠杆菌染色体中G+C% (50.8%)明显要低，提示E. coli O157:H7中ETT2基因簇可能是以毒力岛突变插入的形式存在于菌株中的^[11]；尽管ETT2毒力岛编码蛋白质各自的效应还没有被证实，但对于基因库已发表的ETT2基因来说，位于ETT2两端的ECs3703和ECs3737基因，无论是以整个或突变体形式都存在于ETT2毒力岛中，是检测ETT2毒力岛的标志基因。因此，常用PCR扩增ECs3703和ECs3737基因的方法来检测大肠杆菌中是否存在ETT2毒力岛^[12]。Ren等研究发现在大多数的菌株中，包括E. coli O157:H7菌株，ETT2受到不同程度的突变损耗以至于使它不能够编码功能性分泌系统，而完整的与ETT2有关的基因簇主要存在于O42大肠杆菌中，对于不同致病性的大肠杆菌中ETT2来说，其存在着明显的变异性，序列比对分析显示，在所有的ETT2的35个ORF中，Sakai菌株中包含一些假基因，而EAEC O42没有^[13](图 1)。

近年来，有关畜禽致病性大肠杆菌毒力岛ETT2的存在相继得以证实，ETT2毒力基因簇主要存在于产志贺毒素的致病性大肠杆菌中。Hartleib通过PCR和DNA免疫印迹试图发现ETT2在245株大肠杆菌、25株沙门氏菌和10株其他菌种的分布情况，结果发现ETT2毒力岛主要存在于肠道致病性大肠杆菌中，而在肠道外致病性大肠杆菌(包括血清型O2:H7、O6:H12、O18:H7)、无致病性大肠杆菌(包括血清型O5、O74)以及沙门氏菌、耶尔森菌、志贺氏杆菌等没有发现ETT2的存在^[14]。德国学者Prager等(2004年)对猪源大肠杆菌ETT2毒力岛进行了检测和序列分析，发现O55:H7血清型肠致病性大肠杆菌ETT2毒力基因簇片段只有完整ETT2基因簇的49%，ETT2编码的从ECs3711到ECs3731基因已完全丢失，基因分析显示几乎大多数的肠致病性大肠杆菌ETT2完整性都存在不同程度的丢失，大肠杆菌ETT2分布和缺失的模式镜像初步揭示了ETT2毒力岛的遗传与进化^[15]。Ideses等通过扣除杂交技术对禽致病性大肠杆菌(Avian pathogenic Escherichia coli，APEC) O78菌株的研究，证明了Ⅲ型分泌系统2 (ETT2)不完整基因簇的存在与突变有关，但仍保持APEC原有的毒力^[16]。

图 1　EHEC Sakai和EAEC O42菌株中ETT2基因簇结构特征 Figure 1　Structure of ETT2 gene cluster in strain EHEC Sakai and EAEC O42

图选项

Cheng等在断奶仔猪腹泻以及牛乳腺炎奶牛致病性大肠杆菌的研究中发现都有ETT2存在。结果表明，32.50%的仔猪腹泻病例存在ETT2+大肠杆菌感染，而仔猪水肿病例和仔猪腹泻并发水肿病例的感染率分别为92.11%和91.67%；ETT2+大肠杆菌感染奶牛乳腺炎的感染率为38.98%^[12]；Wang等在研究中发现ETT2基因座主要出现在禽致病性大肠杆菌O78、O2以及O1三个血清型。其中，O78血清型的ETT2退化，而完整的ETT2基因座大多存在于O1及O2血清型的菌株中^[17]。

研究结果表明，APEC分离株中的ETT2存在率与人类所有同种型肠外致病性大肠杆菌(Extraintestinal pathogenic Escherichia coli，ExPEC)包括尿道致病性大肠杆菌(Uropathogenic Escherichia coli，UPEC)和新生儿脑膜炎大肠杆菌(Neonatal meningitis-associated Escherichia coli，NMEC)中的存在率极其相似，其中人腹泻性大肠杆菌为65%，志贺毒素大肠杆菌(Shiga toxin Escherichia coli，STEC)为100%，仔猪和奶牛的分离物中分别为85.9%和47.4%，但UPEC菌株中明显较低(3%)^[18]。此外，研究发现，禽致病性大肠杆菌中的ETT2与人肠外致病性大肠杆菌中的ETT2相比有更多的亚型，但ETT2分泌的效应蛋白与致病能力的关系尚不明确^[19]。

Ⅲ型分泌系统是一个由多组分蛋白复合体形成的跨膜蛋白孔状通道，是许多病原菌用来分泌毒力蛋白或把这些蛋白直接注入宿主细胞以启动生化信息传导的结构，分泌和转移一些主要的毒力决定因子。该结构通常被称为针状复合物(Needle complex，NC)或T3SS注射装置^[20]。它是一个大分子复合物结构，由跨越细菌内外膜的基体和从细菌外膜开始延伸的针状结构复合物组成，包含多种不同的蛋白。T3SS注射装置基体部(Basal body)包括横跨细菌内膜(IM)和外膜(OM)的内环(Inner ring)和外环(Out ring)及位于内外膜之间的颈部(Neck)。针状结构(Needle filament)起始于细菌外膜并向外延伸，是注射装置的核心。易位子(Translocon)是由T3SS注射装置分泌的蛋白质，该装置针状结构的针尖部位(Needle tip)与易位子接触，T3SS分泌的效应蛋白通过易位运动到达细菌液泡膜(VM)上，并形成孔隙，进而使效应蛋白进入宿主细胞内来发挥功能^[21]。目前，与T3SS注射装置相比，国内外对ETT2装置的结构、组成及装配等研究知之甚少，为此我们对ETT2的结构和组成进行了相关的预测和假设。

早期的研究中发现ETT2毒力岛有19个开放性的阅读框与沙门氏菌血清型的SPI-1三型分泌系统高度同源，因而认为ETT2的结构和组成可能与SPI-1类似^[22]，然而，ETT2和SPI-1三型分泌系统之间又有着明显的不同，如spaR作为沙门氏菌编码T3SS注射装置内环的重要蛋白，在ETT2毒力岛中却以epaR1和epaR2的形式存在；InvB分泌蛋白是分泌装置的组成部分，对SopE和SopE2蛋白的分泌也是必需的，生化分析表明SopE和SopE2是作为鸟普酸交换因子交换宿主细胞内的RhoGTP而发挥作用，RhoGTP酶在促炎因子的表达和真核细胞肌动蛋白细胞骨架的重构等重要的细胞活动中发挥重要作用^[23]；InvH虽然不是T3SS注射装置的组成部分，但是InvH能协助InvG蛋白通过易位运动到达细菌的外膜，然而，在ETT2毒力岛中却没有发现InvB和InvH的存在^[24]。此外，SPI-1T3SS注射装置的几个重要基因，如编码内环的prgH以及编码装置针状结构的针尖部位和易位子sipABCD等基因在ETT2中都不存在^[25]。因此，推测肠出血性大肠杆菌O157三型分泌系统2毒力岛本身可能不具备编码功能分泌系统的能力。

对于大多数大肠杆菌菌株来说，ETT2高突变量导致其退化成一个不完整和非功能的T3SS装置，然而，已有研究显示ETT2 T3SS不仅能编码分泌蛋白的T3SS基因座，而且编码的还是注射装置外环的基因座轨迹^[26]。研究结果显示，eip基因座编码SPI-1易位蛋白和T3SS相关蛋白，存在于所有APEC菌株中，其中包含完整的ETT2集群。eip位点可能配合ETT2构建活跃的T3SS装置，进而使完整的ETT2可能会传送不明身份效应物进入宿主细胞以干扰宿主防御，促进细菌感染。为此，研究ETT2完整的结构与组成，进而了解其编码分泌功能具有重要意义。

SPI-1三型分泌系统注射装置的某些重要基因即使不存在ETT2毒力基因簇中或在ETT2毒力基因簇中无功能，但是ETT2毒力岛在肠致病性大肠杆菌的毒力中发挥着重要作用。Hartleib等发现T3SS的ETT2毒力岛编码蛋白可影响大肠杆菌分离株功能的合成、毒素和黏附素的分泌或运输等能力^[14]；存在于败血病大肠杆菌菌株中的ETT2基因组，作用虽然有所退化，但对于败血症的发病机制还是有贡献的。ETT2败血症有几个提前终止密码子和一个大于5 kb片段的缺失，在败血病和新生儿脑膜炎病例中分离的11株大肠杆菌中具有保守性^[16]。无效突变体构成编码假定的内膜分泌环的基因移位，这个内膜分泌环的分泌作用具有显著降低毒力的作用。这个结果首次论证了ETT2发病机制的重要性；在EHEC O157:H7 ETT2基因组中，ECs3720 (etrA)和ECs3734 (eivF)这两个基因的突变会导致由LEE编码的毒力蛋白大量分泌，增强了其人类肠细胞上的粘附作用，EtrA和EivF在LEE毒力岛的基因转录中发挥重要的负调控作用。与这些观察一致的是，在EHEC O26:H菌株中这些调节器的表达导致了在LEE诱导作用条件下的蛋白分泌的抑制。这些发现为与LEE调控力有关的活动基因成分的影响以及与T3SS基因组之间的相互干扰作用提供了鲜活的例子。另外，因为与LEE调控有关的调节基因的作用能够普遍经受住在其他功能基因组中的基因衰变，我们把这种现象称“Cheshire eat effect”。它也有可能表明ETT2调节部分的变更能解释在由LEE编码的蛋白质的分泌作用下发生的种与种之间的变异^[10]。

Ideses等研究发现缺失了ETT2的菌株攻毒1日龄雏鸡，其毒力远低于原始菌株E. coli 789^[16]；Yao等对引起脑膜炎的大肠杆菌K12-EC10菌株进行了ETT2毒力岛敲除以及仅eivA (ECs3732)基因的敲除，结果表明与原始菌株EC10相比，突变株对细胞的入侵率下降50%，细菌在人血管内皮细胞的存活率下降80%，表明ETT2毒力岛在大肠杆菌K12与宿主互作中发挥着重要的致病作用^[27]；Sheikh等研究了沙门氏菌调节子hilA同系物eilA，协同激活与tRNA基因座selC相邻的编码效应蛋白的EivF，进而影响细菌上皮细胞和生物膜形成，间接表明ETT2在细菌中的毒力作用^[28]。

在动物病原菌中，肠出血性大肠杆菌和产志贺毒素大肠杆菌ETT2毒力岛的阳性菌株中总能检测到Stx2e基因的存在^[11]；此外，在其他不同O:H血清型的致病性大肠杆菌中，ETT2毒力岛作用的发挥伴随着其他一个或多个毒力岛的存在，如LEE、HPI、LPA毒力岛^[14]。Prager等通过对266例来自人的临床分离株STEC研究，发现许多毒力基因的表达和分泌受到ETT2毒力岛的影响。Stx2d，一种编码由弹性蛋白酶活化的志贺毒素，通常以自分泌的形式或与ETT2结合的情况下表达分泌，与LEE没有任何作用^[29]。

总之，目前对于ETT2毒力岛的相关功能与机制虽有报道，但仍有许多未知需要探索和研究，同时，探讨ETT2与宿主细胞的相互作用，可为宿主靶标的挖掘提供非常重要的线索和实验理论依据。

致病性大肠杆菌因其复杂多变的血清型，给养殖业带来严重的危害，同时大肠杆菌所携带的毒力基因库可随基因漂移进入食物链，间接对人类健康造成严重威胁。因此，加强对我国致病性大肠杆菌的防控研究，对养殖业和公共卫生都具有重要意义。

大肠杆菌的毒力因子均受遗传控制。一直作为研究热点的细菌毒力调控系统主要有毒力岛、QS系统、二元调控系统等。这些系统又分成许多子调控系统，控制着不同类型毒力基因的表达，在细菌表现毒力的不同阶段起着调控作用。本实验室在已开展的禽源致病性大肠杆菌HPI毒力岛缺失株构建及其致病性研究中发现，HPI毒力岛在禽源大肠杆菌中广泛分布^[30-31]；李丽丽在禽源大肠杆菌主要毒力因子的分子流行病学研究中，首次在国内检出禽致病性大肠杆菌ETT2+ (检出率为41.5%)，结果表明，与HPI毒力岛的检出率、F1菌毛的检出率相差较少，ETT2在禽源大肠杆菌中广泛流行分布^[32]；同时，实验室开展的二元调控系统phoP/Q对禽致病性大肠杆菌致病性相关研究中发现^[33]，phoP/Q可影响群体感应系统和细菌T3SS分泌系统相关基因的功能。ETT2作为大肠杆菌新发现的一种新型毒力岛，其在大肠杆菌毒力调控网络中扮演何种角色，与已知的毒力调控系统，如HPI毒力岛、QS系统、二元调控系统之间存在着何种联系，这都是我们即将要解决的问题。

目前，对于ETT2毒力岛的功能和机制还知之甚少，但是，ETT2毒力岛普遍存在于病原菌EHEC和STEC中，对于兽医和人医来说意义重大，自发现以来一直是国内外学者研究的热点。ETT2虽然不具备编码完整分泌系统的功能，但是近年来的研究显示，ExPEC (APEC、NMEC、UPEC)菌株具有广泛的毒力因子和致病机制，更重要的是，占主导地位APEC血清型O1、O2和O78也涉及各种人类疾病，包括新生脑膜炎和尿路感染，表明家禽可能是人类ExPEC (UPEC和NMEC)毒力基因贮存库。细菌通过水平基因转移的一些机制，可以获得组合移动遗传元素，成为高度适应的病原体，如ETT2毒力基因簇，其在大肠杆菌染色体中的突变插入形式以及C型异构体中发现的IS转座酶，使ETT2能在不同的致病性大肠杆菌中转移；此外，ETT2与LEE毒力岛的毒力基因之间并未发现有任何的相关性，其对于细菌的黏附能力和其他毒力基因的表达调节主要依靠自身的相关毒力基因发挥作用，因此，及时深入地研究ETT2毒力岛，不仅有利于我们认识复杂的微生物世界，了解病原微生物出现的机制，为研究新病原菌及重新抬头的病原微生物提供了新的思路，也为研制有效的减毒疫苗或基因工程疫苗和治疗药物开辟了新的途径。