非洲猪瘟(African swine fever，ASF)是由非洲猪瘟病毒(African swine fever virus，ASFV)引起猪的一种急性、高度接触性传染病^[1]。ASFV属非洲猪瘟病毒科(Asfarviridae)，是虫媒病毒中唯一的DNA病毒^[2]，病毒基因组长约170-190 kb，编码150-200种蛋白质，不同病毒株的基因组长度差异位于基因组左端38-47 kb、右端13-22 kb的可变区域，中央为保守区^[3]。1921年该病在肯尼亚首次被发现报道^[4]，随后在非洲多数国家、欧洲和南美洲相继暴发和流行^[5]，造成严重的经济损失。野猪和软蜱是ASFV的野生储存宿主和传播媒介，导致病毒可在自然界稳定存在，通过感染家猪、野猪和蜱来实现饲养环境与野生环境的循环传播^[6-7]。ASF临床症状和病理变化与猪瘟很相似^[8]，表现为发热、皮肤发绀和淋巴结、肾、胃肠黏膜明显出血，强毒株感染的潜伏期短，死亡率高达100%^[9]。由于该病病原学和流行病学的复杂性，且无有效的疫苗用于防疫，因而被世界动物卫生组织(Office international des epizooties，OIE)列为实时通报的动物疫病，我国将其列为一类动物疫病^[10]。我国是养猪大国，应建立严密、高效的防控系统，包括灵敏、准确的诊断方法及高效的预报预警机制等，以避免ASF传入我国。

虽然我国目前还没有非洲猪瘟疫病的报道，但随着国际贸易往来的日益频繁，该病传入我国的风险也随之增大。俄罗斯大规模暴发ASF疫情^[11]，无疑使得该疫病对我国的威胁进一步加大，病毒一旦传入我国，后果将不堪设想，因此建立一种灵敏、特异的ASFV检测方法具有重要意义。微滴数字PCR (Droplet digital PCR，ddPCR)是近年来兴起的一种新的绝对定量技术，通过极度稀释实现理论上的单分子扩增，然后用终点法PCR和泊松分布计算出样品的原始浓度^[12-13]，在核酸分子的绝对定量领域具有极大的潜力。由于其不需要建立标准曲线，在低浓度的核酸含量下也可高度灵敏和准确地对核酸的拷贝数进行绝对定量，使得ddPCR技术得到国内外越来越多的关注和应用，具有较好的发展前景。本研究通过建立ASFV ddPCR检测方法，并利用该方法对我国进出口相关动物样品及国内动物样品进行检测，为我国对ASFV的实时监控提供数据参考，也为我国防控该病毒的传入提供技术储备。

ASFV K205R全基因序列(GenBank登录号：KP055815)由英潍捷基(Invitrogen^TM)人工合成。猪瘟病毒(CSFV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、日本乙型脑炎病毒(JEV)、猪圆环病毒2型(PCV-2)、猪伪狂犬病毒(PRV)、口蹄疫病毒(FMDV)均由四川农业大学动物检疫实验室保存。临床检测样品共计163份，采集于2016-2017年。其中包括28份中国边境岗哨动物(猪)的血清样本、野猪粪便样本，由军事医学科学院军事兽医研究所馈赠；62份从加拿大进口的种猪血清样本，由四川出入境检验检疫局检验检疫技术中心馈赠；73份国内规模化养猪场采集的有高热症状的猪组织样本，由四川农业大学动物检疫实验室保存。

质粒小量抽提试剂盒、磁珠法病毒DNA/RNA提取试剂盒(Magnetic Viral DNA/RNA Kit)，北京天根生化科技有限公司；微滴生成油(ddPCR droplet generation oil)，Bio-Rad公司。

普通PCR仪、数字PCR系统QX100、96孔板封口机PX1、荧光定量PCR仪CFX96，Bio-Rad公司；超微量分光光度计NanoDrop 2000、全自动核酸提取仪，Thermo公司。

参照NCBI中GenBank登录的ASFV全基因序列(表 1)，通过DNAMAN软件对16株病毒的全基因组序列进行比对，选择K205R基因的保守区域，利用Oligo及Primer Premier软件，设计并合成特异性引物和TaqMan荧光探针，其上游引物F：5′-CAGGCAAAACAAGTGAAACA-3′；下游引物R：5′-GCAAACTGCTCATCCAATAT-3′；探针Probe：5′-FAM-TGTTCTTCACGCGTAGCGAATGGGC-BHQ-3′，探针的5′端标记FAM荧光报告基团，3′端标记荧光淬灭基团BHQ1。引物和探针均由Invitrogen^TM公司合成。

人工合成的ASFV质粒作为模板进行qPCR反应，分别对引物、探针浓度以及反应退火温度进行优化。反应体系为(20 μL)：2×Premix ExTaq 10 μL，上游和下游引物终浓度为250 nmol/L，TaqMan探针终浓度为200 nmol/L，模板1 μL，ddH₂O补足20 μL。反应条件为：95 ℃ 3 min；95 ℃ 15 s，60 ℃ 30 s，40个循环，延伸时进行荧光信号采集。

与qPCR反应相同的引物和探针进行ASFV ddPCR反应，反应步骤包括：体系配制、微滴生成、扩增和信号读取分析4个步骤^[14]。根据试验指南推荐，ddPCR反应体系：2×Supermix for probes (without dUTP) 10 μL，上、下游引物终浓度为900 nmol/L，探针终浓度为250 nmol/L，模板1 μL，ddH₂O补足20 μL。将20 μL反应液加入微滴生成卡DG8中间一排，再将70 μL微滴生成油加入DG8的最底一排，最后在微滴生成卡上覆盖专用胶垫，置入微滴生成仪，自动生成反应微滴。待微滴生成完毕后，从微滴生成卡的最上一排吸取40 μL生成的油滴，加入96孔反应板内，用预热好的PX1热封仪对其进行封膜，封膜运行程序为180 ℃ 10 s。封膜后将96孔板放入PCR仪进行扩增，反应条件为：95 ℃ 10 min；95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，40个循环；98 ℃ 10 min。扩增结束后，将96孔板置入微滴读取仪中进行信号读取，并使用软件Quanta soft V1.3.2.0分析实验数据，获得检测结果并分析。

为评估ASFV qPCR和ddPCR试验的线性关系、灵敏性和扩增效率，用超微量分光光度计NanoDrop 2000测定ASFV质粒浓度，并计算拷贝数后进行系列10倍梯度稀释(10⁸-10⁰ copies/μL)，取适当范围的稀释度作为模板，用已建立的ASFV qPCR和ddPCR测定两种方法的最低检出限度，绘制标准曲线并进行线性分析。

分别提取CSFV、PRRSV、JEV、PCV-2、PRV、FMDV基因组核酸RNA/DNA，RAN反转录成cDNA，已建立的ASFV ddPCR方法分别对其进行检测，同时设置阴性对照，评估该方法的特异性。

以系列10倍梯度稀释的质粒为模板(10⁴-10¹ copies/μL)进行ddPCR反应，每个浓度设立3孔重复，同样的反应条件分别进行3次试验，计算该方法的组间及组内变异系数，评估该方法的重复性。

用已建立的ASFV ddPCR和qPCR检测方法分别对163份临床样品进行检测，对ASFV感染进行实时监控调查。血清样品用商品化试剂盒ASFV ELISA Kit进行复检，确保检测结果的准确性。

根据试验指南推荐制备ddPCR反应体系，对反应退火温度进行优化，建立了ASFV ddPCR检测方法。由图 1可知当退火温度为50-60 ℃时均检测到荧光信号，在58-60 ℃时扩增振幅最大，选择60 ℃为反应退火温度。

图 1　ASFV ddPCR退火温度的优化 Figure 1　The assay was optimized with different annealing temperatures 注：1-7：60.0、59.2、58.0、56.1、53.8、51.0、50.0 ℃；8：阴性对照. Note: 1-7: 60.0, 59.2, 58.0, 56.1, 53.8, 51.0 and 50.0 ℃, respectively; 8: negative control.

图选项

将连续10倍梯度稀释的ASFV质粒作为标准品，已建立的ddPCR和qPCR方法分别对其进行测定，并绘制标准曲线(图 2)。结果显示，ASFV ddPCR和qPCR线性关系R²≥0.998，表明两种方法均具有较好的线性关系。

图 2　ASFV ddPCR (A)和qPCR (B)标准曲线 Figure 2　The standard curves of ASFV ddPCR (A) and qPCR (B)

图选项

测定ASFV质粒浓度，将系列10倍梯度稀释(10⁵–10⁰ copies/μL)的质粒作为模板，测定ASFV ddPCR和qPCR检测灵敏度。结果显示，建立的ASFV ddPCR方法的最低检测极限大约为1×10¹拷贝，ASFV qPCR方法的最低检测极限大约为1×10²拷贝(表 2)。表明ASFV ddPCR比qPCR检测方法具有更高的检测灵敏度，且ddPCR在不需要标准品为参考的同时，能实现样本中核酸含量的绝对定量。

将提取和制备的CSFV、PRRSV、JEV、PRV、PCV-2、FMDV基因组核酸cDNA/DNA作模板，评估建立的ASFV ddPCR方法特异性。结果显示，各孔微滴生成量均衡，微滴数量均大于13 000 (图 3A)，表明试验数据可信，结果成立。而且仅有ASFV检测孔出现阳性微滴，CSFV、PRRSV、JEV、PCV-2、PRV及FMDV均不存在交叉反应，这6种病毒试验孔均未检出到阳性微滴信号(图 3B)。表明建立的ASFV ddPCR检测方法具有较高的特异性。

图 3　ASFV ddPCR特异性试验 Figure 3　Specificity assay of ASFV ddPCR assay 注：A：阳性微滴与总微滴的比例；B：ddPCR荧光振幅. 1-7：CSFV、PRRSV、JEV、PCV-2、PRV、FMDV、ASFV；8：阴性对照. Note: A: The ratio of positive events to total partitions; B: The fluorescence amplitude of ASFV amplification. 1-7: CSFV, PRRSV, JEV, PCV-2, PRV, FMDV, ASFV; 8: Negative control.

图选项

以4个浓度梯度的ASFV质粒为模板进行重复性试验，每个浓度设置3个重复孔，取3孔平均值计算其变异系数。由表 3可知，各浓度的测定、计算拷贝数值与ddPCR软件分析数值基本吻合，组内和组间变异系数分别在2.84%-5.16%、3.68%-5.14%之间，证明所建立的ASFV ddPCR检测方法重复性良好，检测结果可靠。

采用本文所建立的ASFV qPCR和ddPCR检测方法分别对上述共计163份猪样品进行检测，其中血清样本同时采用商业化ASFV ELISA检测试剂盒进行复检。结果显示，ASFV qPCR和ddPCR检测结果均为阴性，血清样品ELISA复检结果与核酸检测结果一致，证实检测结果可信度较高，表明此研究对国内ASFV跨境传播的实时监控中未发现ASFV的感染。

ASF是一种烈性传染病，我国目前尚无ASF疫情的报道，然而ASFV在非洲、欧洲等地区肆虐，造成严重的经济损失^[15]。近年来，中国同非洲国家日益频繁的贸易往来，是我国传入ASF的一个必须引起重视的风险因素。俄罗斯与我国边境漫长，而俄罗斯国内ASF疫情的不断扩散，也严重威胁我国边境地区的安全。ASF一旦传入中国，必定对我国养猪业造成毁灭性打击，目前仍无有效的ASFV疫苗对该疾病进行预防，该病防控的最主要措施仍是检疫，因此建立一种ASFV灵敏且特异的检测方法显得尤为重要。目前，国内对ASFV检测方法的研究主要以编码病毒结构蛋白的p72、p54等基因为主^[16-17]，而K205R研究相对较少。ASFV K205R基因序列非常保守，研究表明病毒在感染宿主细胞4 h后，K205R就在细胞内进行复制与翻译^[18-19]，使得K205R基因逐渐受到国内外越来越多的关注，无论在ASFV感染机体的早期还是中后期，均可用作目标基因来检测病毒抗原，为建立及时检测ASFV方法提供了有力保证，也对今后ASFV检测试剂盒的开发具有重要的指导意义。

微滴数字PCR (ddPCR)是近年来兴起的一种新的绝对定量技术，通过极度稀释实现理论上的单分子扩增，然后利用PCR和泊松分布计算出样品的原始浓度。ddPCR是继普通PCR和qPCR之后的第三代PCR技术，在反应过程中，反应混合液被分割成10 000-20 000个油滴，每个油滴对应一个独立的微滴反应单元，目标DNA也被随机组合到独立微滴中，通过PCR扩增，每个微滴以流式检测的方式逐一被单独检测分析，可以检测样本中极低含量核酸分子，且不需要标准曲线而实现绝对定量。随着该技术的不断发展，ddPCR已经被广泛应用于各种研究，如病原体诊断^[20]、基因突变检测^[21]和转基因研究^[22]等，具有较好的应用前景。与实时荧光定量PCR相比，ddPCR具有更高的检测灵敏度，且无需标准品，也不依赖于标准曲线，采用终点PCR信号计数检测不依赖于C_t值，能有效克服PCR抑制剂的影响，是一种更加理想的进行基因扩增检测和核酸定量分析的新方法。

本研究针对ASFV的K205R基因序列设计特异性引物和TaqMan探针，建立了ASFV qPCR和ddPCR检测方法，并对两种方法的检测灵敏度、线性关系进行比较和分析。试验表明建立的ASFV qPCR和ddPCR检测方法灵敏、特异、准确，构建的标准曲线具有较好的线性关系，组内、组间变异系数均小于6%，重复性较好，ddPCR的最低检测限度为0.36拷贝，约为10拷贝/反应，具有较高的检测灵敏度，在机体低病毒含量的早期感染或潜伏感染的诊断中潜力巨大。该方法与其他猪常见病毒不发生交叉反应，特异性较强，能有效应用于临床样品检测。该方法的建立为我国口岸预防ASFV的侵入提供了有力的技术储备，同时也为病毒的定量检测提供了一种新思路。