目前，世界各国应用于工业生产的醋酸菌主要有醋酸杆菌、葡糖杆菌和葡糖酸醋酸杆菌3个属，而我国主要用于食醋生产的醋酸菌是中科1.41和沪酿1.01，均为醋酸杆菌属中的巴氏醋酸杆菌(Acetobacter pasteurianus，A. pasteurianus)^[1-2]。

醋酸菌能够在膜结合的乙醇脱氢酶(ADH)、乙醛脱氢酶(ALDH)和泛醌氧化酶的复合体共同作用下将乙醇不完全氧化成醋酸，同时乙醇氧化失去的电子和H⁺也在该呼吸链上传递，最终与氧结合生成水并释放能量^[3−5]。一般而言，醋酸对微生物具有毒性的主要原因是其作为亲脂性的物质能够跨越细胞膜进入细胞，增加胞内醋酸的浓度，破坏细胞膜的一些生理功能^[6]。但是，醋酸菌具有特殊的耐酸机制能够耐受较高浓度的醋酸，尤其是醋酸杆菌和葡糖杆菌属菌株，其在3%甚至更高醋酸浓度的条件下仍能够正常生长。大量研究证实，乙醇呼吸链的氧化机制就是醋酸菌中的一个重要耐酸机制。Takemura等^[7]通过自然诱变筛选得到一株ADH活性缺失的巴氏醋酸杆菌，该菌株在含有乙醇的培养基中生长缓慢且不产醋酸，而且在含有醋酸的培养基中不能生长，从而阐述了ADH对醋酸菌的产酸和耐酸具有至关重要的作用。Beppu^[8]将ADH、ALDH基因导入原始菌中过量表达，产酸量达到98.6 g/L，比原始菌株的产酸量提高了40%，也提高了菌体的耐酸能力，证明了ADH和ALDH与醋酸菌的产酸和耐酸有着密切的联系。亓正良等^[9]研究表明巴氏醋酸杆菌的TCA循环途径不完整，无法循环运转，不能在高醋酸环境下依靠TCA循环途径提供能量，并阐述菌株的主要供能代谢途径为乙醇呼吸链代谢途径。Matsushita等^[10]也提出醋酸菌对醋酸的抗性机理是受能量控制的，呼吸链产生的能量可以抵抗醋酸环境。上述研究结果一方面可能是由于质子泵与产酸直接相关^[11]，另一方面可能是能量积累有助于需能的外排机制(如ABC转运子)产生效应^[12]。

高浓度醋酸发酵下的产酸代谢规律以及呼吸链上调控菌体耐酸的关键基因目前尚未被系统报道，因此阐明乙醇呼吸链代谢规律对于醋酸菌的高产酸和耐酸具有重要意义。本文以沪酿1.01工业菌株(A. pasteurianus CICC 20001)和巴氏醋酸杆菌的模式菌A. pasteurianus ATCC 33445菌株为研究对象进行摇床发酵实验。首先构建巴氏醋酸杆菌乙醇呼吸链代谢途径模型，进一步通过探究它们在0、1%、2%、3%不同的初始醋酸浓度条件下的产酸强度、酶活以及乙醇呼吸链相关酶的基因相对转录水平变化，从中找出乙醇呼吸链的产酸代谢规律和调控巴氏醋酸杆菌呼吸链上耐酸的关键基因，为提高醋酸杆菌的耐酸性提供良好的理论依据和现实意义。

1 材料与方法 1.1 材料

1.1.1 主要试剂和仪器: 葡萄糖、酵母粉、无水乙醇、冰醋酸等试剂购于国药集团；PCR扩增引物、RNase-free ddH₂O、Trizol提取试剂盒等荧光定量PCR相关试剂购于生工生物工程(上海)股份有限公司。其他试剂的配置：(1) 50 mmol/L KPB缓冲液(pH 5.8)：称取22.8 g三水合磷酸氢二钾溶于100 mL水中，配制1 mol/L磷酸氢二钾溶液；再称取13.6 g磷酸二氢钾溶于100 mL水中，配制1 mol/L磷酸二氢钾溶液。取1 mol/L磷酸氢二钾溶液5 mL，1 mol/L磷酸二氢钾溶液45 mL，混合并用蒸馏水定容至1 000 mL；(2) Mcllvaine缓冲液(pH 4.0)：称取十二水合磷酸氢二钠2.76 g、柠檬酸1.29 g、乙二胺四乙酸二钠盐3.72 g，混合并用蒸馏水定容至100 mL；(3) 0.1 mol/L铁氰化钾溶液：称取3.29 g铁氰化钾，用蒸馏水定容至100 mL，并放置在4 ℃保存；(4)硫酸铁-Dupanol溶液的配置：称取5 g Fe₂(SO₄)₃·nH₂O和3 g Dupanol (月桂基硫酸钠)，量取95 mL 85%磷酸，混合并用蒸馏水定容至1 000 mL。

超速离心机，日本日立公司；可见分光光度计，上海普美达公司；超声波细胞粉碎机，宁波新芝生物公司；Stepone plus型荧光定量PCR仪，美国ABI公司。

1.1.2 菌种: (1) 巴氏醋酸杆菌沪酿1.01菌株，菌种号为CICC 20001，购买于中国工业微生物菌种保藏管理中心；(2)巴氏醋酸杆菌模式菌株，菌种号为ATCC 33445，购买于美国ATCC。

1.1.3 培养基: (1) 固体培养基(g/L)：葡萄糖10，酵母粉10，琼脂粉20，碳酸钙20，1×10⁵ Pa灭菌20 min，冷却至60左右，加无水乙醇至30 g/L，摇匀后分装斜面或倒平板。(2)种子培养基(g/L)：葡萄糖10、酵母粉10，1×10⁵ Pa灭菌20 min，接种前加无水乙醇至30 g/L。

1.1.4 荧光定量PCR引物: 引物序列采用Primer Premier 5.0软件设计，实验所用引物如表 1所示。

1.2 培养方法

1.2.1 菌种活化: 用无菌吸管吸取1 mL保藏菌液接种于50 mL种子培养基(无乙醇)中，在30 ℃、170 r/min振荡培养24 h。取3 mL菌液于比色皿中，在600 nm波长处测量其吸光值，检测其OD₆₀₀值是否达到0.8−1.0，然后对菌体进行革兰氏染色并观察其形态，判断菌体自身状况是否良好及检查是否染菌，达到标准的可进行摇瓶发酵。

1.2.2 摇瓶发酵: 将制备好的种子按10% (体积比)接种量接入500 mL三角瓶，内含90 mL新鲜发酵培养基，初始醋酸浓度分别为0、1%、2%、3%，30 ℃、170 r/min恒温振荡培养。

1.2.3 平板培养: 将涂布菌液的平板放入30 ℃的恒温培养箱中培养60 h。

1.2.4 转接方法: 在无菌条件下将活化好的菌液转接到不含醋酸的种子培养基中，30 ℃、170 r/min恒温振荡培养24 h后，再转接到含1%初始醋酸浓度的培养基中，并放入摇床继续振荡培养24 h后，再将1%培养的菌液转接到含2%和3%的初始醋酸浓度中培养。

1.3 分析方法

1.3.1 菌体浓度: 采用稀释涂布平板法，分别测定菌体悬浮液的吸光度OD₆₀₀和菌液浓度(CFU/mL)，每组做3个平行实验，取平均值，最后以吸光度OD₆₀₀为横坐标，菌体浓度(CFU/mL)为纵坐标，建立OD₆₀₀与菌体量的标准曲线(图 1)。

1.3.2 菌体产酸测定: 取1 mL发酵液于150 mL三角瓶，稀释50倍，滴加2−3滴1%酚酞，用0.1 mol/L的NaOH标准溶液滴定至微红，30 s内不褪色为滴定终点，根据氢氧化钠标准溶液消耗体积V (mL)计算醋酸浓度：

醋酸浓度(g/L)=C_NaOH×V×60

式中，C_NaOH表示NaOH标准溶液的浓度(mol/L)，V代表滴定消耗NaOH标准溶液的体积(mL)。

1.3.3 蛋白浓度测定: 参照Bradford法测定，用牛血清白蛋白作为标准蛋白。首先配置1 g/L的牛血清蛋白标准溶液，再用去离子水稀释至不同浓度，然后向每支试管中加入5.0 mL考马斯亮兰G-250试剂(每加一管，立即在旋涡混合器上混合)。反应5 min后，用分光光度计检测其在595 nm处的吸光值OD₅₉₅。绘制OD₅₉₅与蛋白浓度的标准曲线，见图 2。

1.3.4 乙醇(乙醛)脱氢酶活力测定: (1) 粗酶液的获取：取相应时间的适量菌液于4 ℃、8 000 r/min条件下离心10 min，去上清，用50 mmol/L (pH 5.8)的磷酸盐缓冲液(KPB)洗涤2次，然后重新悬浮于该缓冲液中(0.1 g湿菌体/3 mL KPB)，在冰浴下进行超声破碎，240 W，2 s/2 s，总时间10 min。破碎液作为粗酶液待用。

(2) 酶活测定：参照Wood氏法^[13]，取0.5 mL Mcllvaine缓冲液(pH 4.0)、1.0 mol/L乙醇(乙醛)溶液0.1 mL、细胞膜0.1 mL和10% Triton X-100 0.1 mL于10 mL比色管中，25 ℃保温5 min后加入0.1 mol/L铁氰化钾溶液0.2 mL，在25 ℃放置反应5 min (同时做空白对照)，然后加入硫酸铁-Dupanol溶液0.5 mL终止反应，25 ℃放置20 min，加入3.5 mL蒸馏水混合后，用紫外分光光度计测定660 nm吸光度。在25 ℃、pH 4.0条件下，1 min氧化l μmol乙醇的酶量为一个酶活力单位。

酶活性(U/mL)=A₆₆₀×1/4×1/5×1/酶液(mL)×稀释倍数；

比酶活(U/mg)=酶活性(U/mL)/总蛋白(mg/mL)。

1.4 荧光定量PCR

取不同初始醋酸浓度下培养的对数中后期菌液，收集约0.1 g湿菌体，立即用液氮速冻保存，用UNlQ-10柱式Trizol总RNA抽提试剂盒提取细菌总RNA，如有DNA污染用DNase Ⅰ去除，按AMV FirstStrand cDNA Synthesis Kit说明书迅速反转录第一链cDNA后稀释备用，反应体系为：5 μL总RNA (0.2 g/L)，1 μL Random Primerp(dN)₆ (0.2 g/L)和5 μL RNase-free ddH₂O。以16S rRNA基因为管家基因，将稀释后的cDNA (50 mg/L)上机检测。反应体系(10 μL)：2×SYBR Green qPCR Master Mix 5 μL，10 μmol/L Primer F 0.2 μL，10 μmol/L Primer R 0.2 μL，ddH₂O 3.6 μL，模板(cDNA) 1 μL。反应条件为：95 95，60，40个循环。循环结束后利用熔解曲线检测产物特异性：从60缓慢升温至97，每5次荧光信号。

相对转录水平的计算采用2^−ΔΔCt法：

ΔC_t=C_{t目的基因}−C_{t内参基因}

ΔΔC_t=ΔC_{t实验组样品}−ΔC_{t对照组样品}

相对转录水平=2^−ΔΔCt

式中，C_{t目的基因}和C_{t内参基因}分别表示目的基因和管家基因的C_t值。

1.5 数据处理

本研究中每个实验共设3个平行，实验数据使用OriginPro8.5和Adobe Illustrator CS6进行统计分析。所有图和表中的数据都是3个平行测量值的平均值，误差线代表标准偏差，显著性分析为P≤0.01。

2 结果与分析 2.1 不同初始醋酸浓度对菌体生长的影响

醋酸作为亲酯性的物质能够跨越细胞膜进入细胞，增加胞内醋酸的浓度，破坏细胞膜的一些生理功能^[5]，从而制约醋酸菌的生长繁殖能力。不同初始醋酸浓度对两种菌株(A. pasteurianus ATCC 33445和A. pasteurianus CICC 20001)生长繁殖的影响结果如图 3所示。在无底酸时，两种菌株生长的菌体量最高，分别约为2.17×10⁸和1.91×10⁸ CFU/mL；随着初始醋酸浓度的提高菌体量逐渐下降，即菌体的生长繁殖能力受到抑制，尤其在3%的醋酸浓度下两种菌体的菌体量最低，分别约为6.14×10⁷和5.70×10⁷ CFU/mL，仅仅只有无底酸浓度下的28.3%和29.8%，而且菌体生长的延滞期也延长至10 h。因此，醋酸对菌体生长繁殖具有很强的抑制作用，醋酸浓度越高，抑制越明显。

2.2 初始醋酸对乙醇呼吸链产酸和酶活的影响

2.2.1 不同初始醋酸浓度下的产酸变化: 醋酸分子进入细胞内后会解离产生更多的醋酸根离子，导致胞内pH值下降，从而影响菌体产酸^[14]。不同浓度醋酸对两种菌株产酸的影响如图 4所示，与Wang等^[15]报道的结果类似，当醋酸起始浓度为1%时，A. pasteurianus ATCC 33445和A. pasteurianus CICC 20001菌株的产酸能力都达到最佳，最高分别可以产酸33.6和30 g/L，发酵48 h平均产酸速度达到0.667 g/(L·h)。但随着醋酸浓度的继续提高，当在2%和3%的初始醋酸浓度下时，菌株的产酸能力就变得越来越弱，尤其在3%醋酸浓度条件下，它们各自只能产酸19.8和18.6 g/L，发酵48 h平均产酸速度只有0.319 g/(L·h)。综上分析，一定浓度的醋酸对菌株的产酸能力具有促进作用，但醋酸浓度过高时，它们的产酸能力就会受到抑制。

2.2.2 醋酸发酵过程中乙醇呼吸链的酶活变化: 醋酸菌是在ADH帮助下将乙醇氧化成乙醛，并在ALDH的帮助下继续将乙醛氧化成乙酸^[4]。图 5显示了两种菌株在不同初始醋酸浓度下进入对数生长期后12 h的ADH和ALDH酶活变化。从图 5中可以看出，巴氏醋酸杆菌在1%的初始醋酸浓度下，ADH (ALDH)的酶活最高，A. pasteurianus ATCC 33445和A. pasteurianus CICC 20001两种菌株的酶活分别为12.88 (11.03)和11.14 (8.51) U/mg，两种菌株的平均酶活达到12.01 (9.77) U/mg。随着初始醋酸浓度的继续提高，它们的酶活逐渐降低，在3%的初始醋酸浓度下，ADH (ALDH)的酶活只有6.97 (4.39)和6.25 (3.82) U/mg，它们的平均酶活为6.61 (4.11) U/mg。这说明起初添加适量醋酸会增强ADH和ALDH基因的表达，从而提高了它们的酶活；但当醋酸浓度过高时，菌体就会降低酶活，减少产酸，以降低醋酸对自身的伤害，与菌株的产酸曲线相吻合。

2.3 不同初始醋酸浓度对乙醇呼吸链若干酶活与基因转录水平的影响

醋酸菌能通过一些耐酸机制来实现高浓度醋酸条件下的生长和代谢，而乙醇呼吸链不仅涉及菌株的产酸，同时涉及耐酸。因此，首先确定乙醇呼吸链的代谢模型，并筛选乙醇呼吸链代谢途径相关酶的合成基因，探究它们在初始醋酸浓度分别为0、1%、2%、3%条件下各自相对转录水平的变化，从而找出调控醋酸菌耐酸的关键基因。

2.3.1 乙醇呼吸链代谢途径相关酶合成基因转录水平分析: 参考模式菌株A. pasteurianus ATCC 33445代谢途径信息构建实验菌株呼吸链的主要代谢途径^{[5, 16]}，勾勒巴氏醋酸杆菌乙醇呼吸链的模型，如图 6所示。醋酸菌的产酸机制是醋酸菌能在以吡咯喹啉醌(PQQ)作为辅酶的乙醇脱氢酶(ADH)和乙醛脱氢酶(ALDH)以及泛醌氧化酶的复合体共同作用下，将乙醇不完全氧化成醋酸，而且乙醇氧化过程中失去的电子可以被膜上自由穿梭移动的辅酶Q吸收，得到电子的辅酶Q结合H⁺由氧化态变成还原态，还原态辅酶Q被末端氧化酶(巴氏醋酸杆菌呼吸链上常见的末端氧化酶是细胞色素o和细胞色素bd末端氧化酶)氧化，最终电子被细胞质中的溶解氧获得生成H₂O，从而完成了整个乙醇呼吸^[17-18]。在整个呼吸过程中，胞内H⁺同时还被末端氧化酶泵到了膜外侧，从而形成质子梯度，推动三磷酸腺苷酶(ATPase)产生ATP，为细胞提供正常代谢和抵抗醋酸所需要的能量。

根据呼吸链的代谢模型，筛选了乙醇呼吸链相关酶合成基因(表 2)做荧光定量分析，探究A. pasteurianus ATCC 33445和A. pasteurianus CICC 20001菌株在初始醋酸浓度分别为0、1%、2%、3%条件下各自相对转录水平的变化。荧光定量PCR检测结果如图 7所示，当初始醋酸浓度为1%时，A. pasteurianus ATCC 33445菌株和A. pasteurianus CICC 20001菌株体内与呼吸链相关的基因相对转录水平较无底酸条件下都提高了，该变化与菌株在1%条件下的产酸能力提高相一致，说明在该浓度下对菌体产酸有促进作用。当初始醋酸浓度为2%或3%时，A. pasteurianus ATCC 33445菌株的大部分呼吸链酶合成基因相对转录水平都开始下降，只剩cyt o、fapA、cyt bd、adh仍保持较高转录水平，最高的相对转录水平是无底酸条件下的17.30、1.78、8.74和12.41倍；A. pasteurianus CICC 20001菌株中也只有cyt o、fapA、cyt bd和adh仍保持较高转录水平，最高是无底酸条件下的3.43、2.33、1.24和12.23倍，其他基因的转录水平都降低。这表明在高初始醋酸浓度条件下，菌体会大幅度提高adh的转录水平，这一方面是为了提高巴氏醋酸杆菌的耐酸性^[7]，另一方面是因为乙醇对菌体也有一定伤害，提高adh基因转录水平可以加速消耗乙醇，降低伤害。但菌体会降低aldh的转录水平，降低它的酶活，从而抑制菌体将乙醛转化成醋酸。同时，菌体还会提高乙醇呼吸链cyt o和cyt bd的转录水平，加速H⁺的外排，催化ATPase将ADP转化成ATP，供菌体使用。综上，在高浓度醋酸条件下，菌体首先会自发提高adh的转录水平，启动底物磷酸化，加快电子和质子传递，释放能量供机体使用，将醋酸泵出到胞外；同时让aldh基因的表达受到抑制，降低产酸，维持体内较低醋酸浓度，这可能是菌体在高醋酸浓度下的一种自适应机制。此外，呼吸链上其他外排相关酶转录水平也会提升，如cyt bd和cyt o，它们是底物磷酸化进程的一部分，会加速催化释放ATP，以抵抗高醋酸的不利环境。

2.3.2 乙醇呼吸链上adh/aldh相对转录水平与酶活之间的关系: 由于首次发现了在高醋酸浓度下巴氏醋酸杆菌产酸路径会存在一个自适应机制。因此进一步分析了乙醇脱氢酶和乙醛脱氢酶在不同初始醋酸浓度下进入对数生长期后12 h的转录水平与酶活之间的关系。

A. pasteurianus ATCC 33445和A. pasteurianus CICC 20001菌株乙醇脱氢酶的转录水平与酶活之间的关系如表 3所示。从表 3中可以看出，A. pasteurianus ATCC 33445菌株和A. pasteurianus CICC 20001菌株一开始会随着醋酸浓度的上升提高adh基因的转录水平，从而提高ADH酶活；但当醋酸浓度达到2%甚至更高时，虽然它的转录水平会随着醋酸浓度的继续增加而提高，但是ADH的酶活却会逐渐降低。ADH出现负相关，表明在翻译层次，也出现了自适应机制，即转录水平虽然得到了提高，但是酶活并没有得到明显提高，而整体性随着酸度升高，其产酸通路逐渐减慢。

A. pasteurianus ATCC 33445和A. pasteurianus CICC 20001菌株乙醛脱氢酶的转录水平与酶活之间的关系如表 4所示。从aldh基因的转录水平和酶活的变化中可以发现，A. pasteurianus ATCC 33445和A. pasteurianus CICC 20001菌株一开始随着醋酸浓度的上升，也会提高aldh基因的转录水平，从而提高ALDH酶活；当醋酸浓度达到2%甚至更高时，aldh基因的转录水平会随着醋酸浓度的继续增加而降低，ALDH的酶活也会随着降低。这表明aldh基因的转录水平与酶活一直成正相关的关系，ALDH才是乙醇氧化代谢途径的限速酶。

3 结论与讨论

醋酸对巴氏醋酸杆菌的生长繁殖和产酸的影响与Wang等^[15]的研究结果相吻合。大量研究结果证实，巴氏醋酸杆菌能够抵抗醋酸的伤害，主要是因为其体内具有一系列耐酸机制。但是高浓度醋酸发酵下的产酸代谢规律以及呼吸链上调控菌体耐酸的关键基因尚未见系统报道。

研究表明，巴氏醋酸杆菌在高浓度初始醋酸浓度培养时，菌体代谢系统发生自发调节，一方面提高adh基因的转录水平，启动底物磷酸化，从而释放能量供机体使用，将醋酸泵出到胞外；同时让aldh基因的表达受到抑制，降低产酸，维持体内较低醋酸浓度。adh和aldh的这种变化可能是菌体在高酸浓度下的一种自适应机制。另一方面，呼吸链上cyt bd、cyt o和fapA相关酶转录水平也会提升，它们会辅助底物磷酸化进程，加速催化释放ATP，以抵抗高醋酸的不利环境。但是由于不同醋酸菌的末端氧化酶有所不同，所以在不同生存条件下细胞会自行调节使用末端氧化酶参与呼吸代谢^{[17, 19]}，所以A. pasteurianus CICC 20001和A. pasteurianus ATCC 33445菌株的cyt o和cyt bd基因转录水平变化存在一定的差异。

研究中还发现，虽然检测到adh基因在高浓度醋酸条件下有较高的转录水平，但是ADH在高浓度醋酸条件下酶活却很低，主要原因可能是：此时转录与转译并非一一对应的关系，转译过程需要一定的能量，在高浓度醋酸胁迫的情况下，菌体消耗能量既用于维持自身的生命活动，又要快速形成ABC转运系统^[12]和应激蛋白^[20−21](GroEL/S、DnaJ/K)，以抵御醋酸对机体的伤害。Inoki等^[22]和Liu等^[23]的研究也曾指出，能量供给不足将减弱有关酶类的转译水平。

综上，A. pasteurianus CICC 20001和A. pasteurianus ATCC 33445菌株在测试过程中呼吸链应答情况相对平行，说明上述分析的规律应为客观存在。后续研究中，可进一步通过优化adh、aldh、cyt o、cyt bd、fapA表达的条件，促进Acetobacter pasteurianus呼吸链活力的增强，从而提高产醋酸和耐高酸的能力。