2022, Vol. 38中国科学院微生物研究所、中国微生物学会主办
文章信息
- 吴彤, 刘婷婷, 刘依铭, 赵雪滢, 刘玉芬, 刘鹏, 赵文阁
- WU Tong, LIU Tingting, LIU Yiming, ZHAO Xueying, LIU Yufen, LIU Peng, ZHAO Wenge
- 东北林蛙瘦素受体叠加转录蛋白基因的克隆及组织表达分析
- Cloning and tissue expression analysis of the LepROT gene of Rana dybowskii
- 生物工程学报, 2022, 38(5): 1859-1873
- Chinese Journal of Biotechnology, 2022, 38(5): 1859-1873
- 10.13345/j.cjb.210615
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文章历史
- Received: August 13, 2021
- Accepted: December 2, 2021
- Published: December 22, 2021
引用本文
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瘦素(leptin, LEP) 是由脂肪组织产生的一种因子[1]，可以调节机体能量稳态、食物摄入平衡和新陈代谢[2]，还具有参与身体生长发育[3-4]、繁殖[5]和抵抗病原体入侵的免疫反应[6]。研究证实，瘦素的生物学功能需要瘦素受体(leptin receptor, LEPR) 的参与。在免疫细胞表面可检测到LEPR的表达，揭示了LEPR与免疫系统的密切关系[5]。LEPR在没有瘦素的情况下以二聚体形式存在，并与配体结合时被激活。研究表明[7-8]，LEPR的选择性剪接可形成不同种的剪接产物，其中有一种独特的蛋白被称为瘦素受体叠加转录蛋白(leptin receptor overlapping transcript, LepROT)，其与LEPR使用相同的启动子和外显子，但氨基酸结构并不相似[8]。研究发现，LepROT和LEPR基因可以在大鼠下丘脑中共表达[9]，如果使LepROT基因沉默，将会增加瘦素信号通路的表达[10]。目前，LepROT的同源基因的克隆已经在人[8]、小家鼠[11]、斑马鱼[12]、南美白对虾[13]等物种中实现，然而其生化机制的相关信息依然有限。
东北林蛙(Rana dybowskii) 隶属蛙科(Ranidae)、林蛙属(Rana)，是可以抵御寒冷条件的东北地区优势两栖物种[14-15]。其生存过程中容易受到嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila, Ah) 的感染，导致其出现红腿病，进而引发败血症等变化[16]。而LPS是一种特异性的病原相关分子模式(pathogen-associated molecular pattern, PAMP)，该分子可被TLR4分子所识别，并通过髓样分化因子(myeloid differentiation factor 88, MyD88) 和IκB激酶(inhibitor of nuclear factor kappa-B kinase, IKK)等接头蛋白将信号传递入细胞核，进而激活效应分子的表达以及核转录因子(nuclear factor-κ- gene binding, NF-κB) 信号通路的启动，完成免疫应答[17-18]。
本研究拟对感染Ah与LPS的东北林蛙不同组织、不同时间点基因LepROT、NF-κB、IKKα和IKKβ的相对表达量进行检测，分析LepROT基因与机体抗感染特性之间的关系，为LepROT基因的免疫功能研究提供参考。
1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 试验动物及菌株成体雄性东北林蛙(20±5) g。嗜水气单胞菌株DW1701-1909 (Ah) 由本实验室分离鉴定。在LB固体培养基上，呈灰白色圆形小菌落。传代培养后通过平板计数法测定菌液浓度，并分别制备1.0×107、1.5×107、1.0×108和1.0×1010 CFU/mL共4个浓度梯度的菌悬液。采用腹腔注射法，暂养一周，每天观察，确定东北林蛙的半数致死剂量(median lethal dose, LD50) 为1.5×107 CFU/mL。
1.1.2 试剂来源克隆载体pMD18-T、感受态细胞大肠杆菌Esherichia coli DH5α、DL2000 marker、Ex Taq DNA聚合酶、T4 DNA连接酶、dNTPs、琼脂糖、胶回收及TRIzol试剂盒、HiScript Ⅱ Q RT SuperMix for qPCR (+gDNA wiper) 和ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix购于南京诺唯赞生物科技有限公司; 其他试剂均为国产分析纯。
1.2 方法 1.2.1 菌种复苏、动物攻毒和样本采集将本实验室保存的嗜水气单胞菌种复苏、平板划线培养，挑取单菌落接种于LB液体培养基中，180 r/min、28 ℃条件下摇床培养[19]，OD600检测菌液浓度范围为0.4−0.6时，通过预试验确定菌悬液浓度。将细菌悬液稀释为1.5×107 CFU/mL，4 ℃备用。将东北林蛙随机分为3组，每组27只。本实验设Ah组、LPS组和LB组(对照)，嗜水气单胞菌悬液(1.5×107 CFU/mL)、LPS溶液(1 mg/mL，溶于灭菌的LB培养基中) 和LB培养液各1 mL，以上3组模型均使用腹腔注射法。分别取注射后8、16、24、36、48、72、96、120、168 h的3组东北林蛙心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、皮肤、肌肉和胃组织样品。以上9个时间点每组取3只，用于后续相关实验。东北林蛙按照美国国立卫生研究院(National Institutes of Health) 实验室动物护理和使用指南的建议实施计划。本研究方案已由哈尔滨师范大学生命科学与技术学院动物实验伦理委员会(编号：hFRI2020) 审核通过。
1.2.2 引物设计根据与东北林蛙同源性较近的物种——中国林蛙，其LepROT基因的序列(GenBank登录号：XM_040360761.1)，使用Primer Premier 5.0软件设计引物，LepROT-B片段长度为329 bp左右，LepROT-q-A (用于qRT-PCR试验) 长度为249 bp，将以上产物进行拼接，得到LepROT扩增片段跨度为396 bp，引物β-actin、NF-κB、IKKα和IKKβ参考文献[20-22]，用于qRT-PCR，引物序列见表 1。
| Primer names | Primer sequences (5′→3′) | Purpose/Length (bp) |
| LepROT-q-FA | AACGCTGAGACGACAATTCC | 249 |
| LepROT-q-RA | TAACATGGCGGGGATTAAAG | |
| LepROT-FB | TGCTTGGATGTGCCTTAG | 329 |
| LepROT-RB | CCACTGCTCCCAACTAAA | |
| β-actin-F | AAGAATGAGGGCTGGAACA | qRT-PCR analysis |
| β-actin-R | GTGCGTGACATCAAGGAGAAGC | |
| NF-κB-A | AGGAGGTTCTGGAGGTTT | qRT-PCR analysis |
| NF-κB-B | GAGGAGTCGGCTTTCATT | |
| IKKα -A | CAAGCTGTAACCACGTCTC | qRT-PCR analysis |
| IKKα -B | GGCCATTTCTACATAACATGC | |
| IKKβ-A | TTTTGAGGATCTGTGCCCCTT | qRT-PCR analysis |
| IKKβ-B | CAATGGCACGCAAAAGTACGA |
使用TRIzol试剂盒从脾脏细胞中提取组织样品的总RNA，采用1%的水平式琼脂糖凝胶电泳检测其完整性并用紫外分光光度计(Beckman, Brea, CA, USA) 检测确定浓度。根据反转录试剂盒合成cDNA第一链，按照Taq plus DNA聚合酶说明书进行PCR反应体系的配置(54 ℃退火30 s, 30个循环)。得到PCR产物后进行胶回收纯化，与pMD18-T载体进行连接，并转入到大肠杆菌DH5α中，经PCR检测，获得的菌株命名为pMD18-T-LepROT-B，将该菌株进行序列测定。使用SWISS-MODEL (http://www.expasy.ch/swissmod/SWISS-MODEL.html)、DNAMAN 6.0、MEGA7.0和SOPMA (https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/secpred sopma.pl) 等软件对LepROT的核苷酸和氨基酸序列进行生物信息学分析[15]。参考物种信息见表 2。
| Species | Accession No. of nucleotide | Accession No. of amino acid |
| Rana temporaria | XM_040360761 | XP_040216695 |
| Xenopus laevis | NM_001093878 | NP_001087347.1 |
| Xenopus tropicalis | NM_001017102 | NP_001017102.1 |
| Bufo bufo | XM_040407057 | XP_040262991.1 |
| Nothobranchius furzeri | HADY01019498 | SBP57983.1 |
| Takifugu rubripes | NM_001136149 | NP_001129621.1 |
| Alligator sinensis | XM_025212552 | XP_025068337.1 |
| Gallus gallus | NM_001007958 | NP_001007959.1 |
| Homo sapiens | BC011027 | AAH56250.1 |
| Pan troglodytes | XM_016920167 | XP_016775656.1 |
| Rattus norvegicus | NM_020099 | NP_064484.1 |
| Mus musculus | NM_175036.4 | NP_778201.1 |
| Ochotona curzoniae | XM_040978417 | XP_040834351.1 |
| Ursus maritimus | XM_040627188 | XP_040483122.1 |
| Bos taurus | NM_001034741 | NP_001029913.1 |
| Sus scrofa | NM_001145388 | NP_001138860.1 |
| Oryx dammah | XM_040232662 | XP_040088596.1 |
| Monodon monoceros | XM_029228450 | XP_029084283.1 |
以β-actin的mRNA相对表达量作为内参，采用SYBR Green I嵌合荧光法检测LepROT、NF-κB、IKKα和IKKβ基因在东北林蛙组织(心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、皮肤、肌肉和胃) 中mRNA的表达情况。反应体系20 μL，包含2×ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix 10 μL，LepROT-q-FA (10 μmol/L) 0.4 μL，LepROT-q-RA (10 μmol/L) 0.4 μL，ddH2O 7.8 μL，cDNA模板1 μL。反应程序按照ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix的说明书，设置3次技术重复。使用2–ΔΔCT法计算相对表达量，利用SPSS25软件采用单因素方差分析法分析其相对表达量，统计学意义为P < 0.01或P < 0.05，利用GraphPad Prism 8软件进行作图。
1.2.5 苏木精-伊红染色(hematoxylin-eosin staining, HE) 分析分别采集东北林蛙感染前与感染后168 h的肝脏、皮肤和肌肉组织，置于中性甲醛缓冲液中固定。然后，在乙醇中脱水，用于常规石蜡包埋。切片(6 μm) 放置在涂有聚L-赖氨酸(Sigma- Aldrich, St. Louis, MO, USA) 的载玻片上，用HE染色进行组织学观察。脱蜡复水二甲苯Ⅰ 5 min，二甲苯Ⅱ 5 min，1/2二甲苯5 min，无水乙醇Ⅰ 3 min，无水乙醇Ⅱ 3 min，95%乙醇Ⅰ3 min，95%乙醇Ⅱ 3 min，90%乙醇3 min，80%乙醇3 min，70%乙醇3 min，ddH2O 5 min，然后用苏木精染色10 min[23]。接下来，用ddH2O冲洗去除残留的颜色，在1%的盐酸乙醇中停留片刻进行分化，1%的氨水停留片刻进行蓝化，用水冲洗3 min，0.5%伊红染液染色3 min后，对载玻片进行梯度脱水和透明试验，使用中性树胶封片[15]。
2 结果与分析 2.1 感染鉴定剖检发现，与未感染组相比，其他2组的东北林蛙发病现象基本一致。东北林蛙在感染后8-16 h无明显变化; 在24 h后肝脏肿大变白出现充血(图 1A2)，腿部肌肉有出血点(图 1B2);48-168 h腹腔可见腹水; 96-168 h东北林蛙头部和背部出现溃烂(图 1C2) 且行动迟缓等现象，表明人工感染成功。
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| 图 1 感染Ah前后的东北林蛙的病理解剖变化 Fig. 1 Pathological and anatomical changes of Rana dybowskii before and after infection with Ah. (A1), (B1) and (C1) were liver, skin and muscle of the uninfected control group, respectively. (A2) Hepatomegaly of R. dybowskii. (B2) There are hemorrhagic spots in leg muscles of R. dybowskii. (C2) Ulceration on the head and back of R. dybowskii, the arrow points to the above symptoms. |
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将HE染色后的结果进行分析发现，对照组和感染Ah 168 h后的东北林蛙组织发生明显变化。阴性对照组的肝脏组织紧密，细胞间隙小; 皮肤结构完整，组织致密; 肌肉组织结构致密。而感染后的肝脏组织中肝细胞壁消失，空泡变性，细胞间隙增大，肝细胞核缩小，炎症细胞浸润; 而皮肤细胞之间的界限变得不清晰，整体结构变得松散，另外，表皮脱落，皮肤结构不完整，腺泡腔内充满大量红细胞; 在肌肉组织中发现，肌纤维变化明显，发生扭曲、断裂和崩解(图 2)。
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| 图 2 感染前后东北林蛙的病理组织变化 Fig. 2 Pathological changes of Rana dybowskii after infection. (A1), (B1) and (C1) respectively show the liver, skin and muscle tissues of R. dybowskii in the negative control group; (A2), (B2) and (C2) showed the changes of liver, skin and muscle tissues of R. dybowskii after Ah infection for 168 h. |
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紫外分光光度计检测所提取样品总RNA的OD260/OD280均在1.8−2.0之间，1%琼脂糖凝胶电泳检测总RNA质量，其28S、18S和5S RNA条带清晰，质量符合要求，可进行后续试验。以脾脏的cDNA为模板，扩增LepROT-q-A、LepROT-B，依据琼脂糖凝胶电泳图(图 3A，3C)的检测结果，条带大小分别为249 bp和329 bp左右，进行胶回收后将纯化的LepROT-q-A、LepROT-B片段和pMD18-T连接，转化大肠杆菌DH5α，再进行菌落PCR鉴定，电泳结果可见菌落PCR条带清晰单一(图 3B，3D)。
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| 图 3 LepROT基因的克隆及鉴定 Fig. 3 Cloning and identification of LepROT in Rana dybowskii. (A) PCR amplification of LepROT-q-A fragment of R. dybowskii. M: DL2000 marker; lane 1: PCR product of LepROT-q-A gene. (B) PCR identification of LepROT-q-A fragment colony of R. dybowskii. M: DL2000 marker; lanes 1–2: the products of colony PCR. (C) PCR amplification of LepROT-q-B fragment of R. dybowskii. M: DL2000 marker; lanes 1–3: PCR products of LepROT-B gene. (D) PCR identification of LepROT-q-A fragment colony of R. dybowskii. M: DL2000 marker; lanes 1–5: the products of colony PCR. |
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经序列拼接获得东北林蛙LepROT基因的全编码区(NCBI登录号为MZ089743)，序列长为396 bp，与已知的中国林蛙LepROT核苷酸序列的同源性达97.22%;在蛋白质一级结构上，该基因编码了131个氨基酸残基; 在二级结构上，运用SOPMA软件分析表明，LepROT基因的蛋白包含α螺旋占35.11% (46个氨基酸)，延伸链占29.77% (39个氨基酸)，β转角占8.40% (11个氨基酸) 和无规卷曲占26.72% (35个氨基酸)等几种结构形式; 在三级结构上，采用SWISS-MODEL软件模拟预测该蛋白结构(图 4A)，与模式生物非洲爪蟾的LepROT的三级结构(图 4B) 类似。运用DNAMAN6.0软件将东北林蛙的LepROT与表 2中18个物种的LepROT进行氨基酸序列比较，发现该蛋白与两栖类同源性在93.74%以上，其中与中国林蛙同源性最高(96.18%)，并且与哺乳类相比同源性在86.39%以上。使用MEGA7.0构建LepROT氨基酸的系统进化树，进化树显示其与两栖类处在同一分支，亲缘关系最近(图 5)。
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| 图 4 LepROT的三级结构模型 Fig. 4 The LepROT tertiary structure model. Using the Swiss Model to predict the tertiary structure of LepROT of Rana dybowskii (A) and Xenopus laevis (B). |
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| 图 5 LepROT系统进化树分析 Fig. 5 Phylogenetic tree of LepROT. Evolutionary analysis of LepROT amino acid sequences. The MEGA software was used for analysis, and the neighbor-joining (NJ) method was used to construct a phylogenetic tree (bootstrap=500) in MEGA7.0. |
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通过数据分析得知，Ah组与LPS组东北林蛙的LepROT基因在所有组织中不同时间点均有不同水平的表达。在心脏组织中，Ah和LPS处理后LepROT mRNA表达量变化大致相同，均呈现先下调后上调再下调的状态，但Ah组的LepROT相对表达量上调时间更长，且上调时间有一定的延滞性; Ah组在8-48 h显著下调，72-120 h显著上调; LPS组在48 h达到峰值，为阴性对照组的1.49倍(P < 0.01)。Ah组肝脏中LepROT mRNA的相对表达量均显著上调(除120 h外)，在16 h时达到峰值，为对照组的19.65倍(P < 0.01);而LPS组的肝脏组织则先上调后下调，在48 h达到峰值，为对照组的5.59倍(P < 0.01)。在脾脏组织中，Ah组和LPS组的LepROT mRNA表达量变化大致一致，均呈现先上升后下降，均在24 h出现峰值，分别为对照组的8.10倍和7.68倍(P < 0.01)。在肺脏组织中2个试验组的LepROT mRNA表达量变化明显不同，Ah组在16 h时达到峰值，为对照组的3.21倍; 而LPS组在168 h时达到峰值，为对照组的3.16倍。在肾脏组织中两试验组的LepROT mRNA相对表达量显著上升，Ah组在48 h时达到峰值，为对照组的6.64倍(P < 0.01);而LPS组则在24 h时达到峰值，为对照组的6.88倍(P < 0.01)。皮肤组织中的LepROT mRNA相对表达量显著上调，且前者比后者上调明显，Ah组在8 h时就达到了峰值，为对照组的9.25倍(P < 0.01);而LPS组在24 h时达到峰值，为对照组的5.57倍(P < 0.01)。肌肉组织与其他组织不同的是，Ah组和LPS组的LepROT mRNA相对表达量呈现相反的变化，Ah组在8-72 h显著上调，而LPS组显著下降。胃的LepROT mRNA相对表达量Ah组在24 h时达到峰值，为对照组的2.37倍; 而LPS组LepROT mRNA相对表达量在16 h时达到峰值，为对照组的1.54倍，较其他组织变化不明显。上述结果表明，感染Ah与LPS胁迫的LepROT基因在不同组织的应答时间和水平存在差异(图 6A-H)。
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| 图 6 嗜水气单胞菌和LPS处理后东北林蛙LepROT mRNA表达量的变化 Fig. 6 The relative expression of LepROT mRNA in different tissues in Rana dybowskii after infection with Ah and LPS injection. (A) Heart. (B) Liver. (C) Spleen. (D) Lung. (E) Kidney. (F) Skin. (G) Muscle. (H) Stomach, the samples were collected at different time points after Ah or LPS (x-axis). β-actin as an internal control. The results were expressed as the x±s error (bars) of three replicates. *: P < 0.05 vs. LepROT expression on uninfected control group; **: P < 0.01 vs. LepROT expression on uninfected control group. |
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与LepROT mRNA相似，感染Ah与LPS的东北林蛙的IKKα基因在所有研究组织中不同时间点均有不同水平的表达。在心脏组织中，Ah组和LPS组无显著提升，只有LPS组在16 h时心脏组织的IKKα mRNA显著上调，为对照组的7.32倍(P < 0.01)。在肝脏组织中，Ah组显著上调，在24 h达到峰值，为对照组的3.47倍(P < 0.01);而LPS组IKKα mRNA相对表达量也有上调，但上调没有前者明显。在脾脏组织中，Ah组与LPS组表达量均显著上调，且Ah组较LPS组表达量显著上调，IKKα mRNA相对表达量变化显著，Ah组在16 h达到峰值，为对照组的9.37倍(P < 0.01);而LPS组的峰值在48 h才出现，为对照组的7.51倍(P < 0.01)。Ah组与LPS组在肺脏组织中，表现出相反的变化规律，Ah组在16 h和24 h显著上调，而LPS组在72 h和96 h显著上调。在肾脏组织中，二者差异明显，Ah组在24 h达到峰值，为对照组的3.41倍(P < 0.01);而LPS组在96 h达到峰值，为对照组的2.65倍(P < 0.01)。皮肤组织则与肾脏组织相反，LPS组显著上调，尤其在96 h出现峰值，为对照组的7.41倍(P < 0.01)。在肌肉组织中，2试验组都没有明显变化，只有在96 h时，LPS组为对照组的9.47倍(P < 0.01)。在胃组织中，Ah组无明显变化，而LPS组在120 h达到峰值，为对照组的7.55倍(P < 0.01) (图 7A-H)。
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| 图 7 嗜水气单胞菌和LPS处理后东北林蛙IKKα mRNA表达量的变化 Fig. 7 The relative expression of IKKα mRNA in different tissues in Rana dybowskii after infection with Ah and LPS injection. (A) Heart. (B) Liver. (C) Spleen. (D) Lung. (E) Kidney. (F) Skin. (G) Muscle. (H) Stomach, the samples were collected at different time points after Ah or LPS (x-axis). β-actin as an internal control. The results were expressed as the x±s error (bars) of three replicates. *: P < 0.05 vs. LepROT expression on uninfected control group; **: P < 0.01 vs. LepROT expression on uninfected control group. |
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IKKβ mRNA表达量变化与IKKα的mRNA表达量变化基本一致。只有LPS组的心脏组织，IKKβ与IKKα在16 h达到峰值，为对照组的4.03倍(P < 0.01)。肝脏、肺脏、肾脏、皮肤、肌肉和胃组织中IKKβ也与IKKα的表达变化情况基本一致。仅在感染后的脾脏组织中，东北林蛙的LPS组IKKβ mRNA相对表达量比Ah组高，LPS组在48 h达到峰值，为对照组的7.34倍(P < 0.01)，表明IKKα与IKKβ具有同步性(图 8A-H)。
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| 图 8 嗜水气单胞菌和LPS处理后东北林蛙IKKβ mRNA表达量的变化 Fig. 8 The relative expression of IKKβ mRNA in different tissues in Rana dybowskii after infection with Ah and LPS injection. (A) Heart. (B) Liver. (C) Spleen. (D) Lung. (E) Kidney. (F) Skin. (G) Muscle. (H) Stomach, the samples were collected at different time points after Ah or LPS (x-axis). β-actin as an internal control. The results were expressed as the x±s error (bars) of three replicates. *: P < 0.05 vs. LepROT expression on uninfected control group; **: P < 0.01 vs. LepROT expression on uninfected control group. |
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NF-κB mRNA的相对表达量也与IκB激酶相对表达量变化基本一致。东北林蛙的心脏组织在LPS刺激下，NF-κB mRNA转录水平在16 h达到峰值，为对照组的1.84倍(P < 0.01);而在Ah的刺激下，在96 h达到峰值，为对照组的1.75倍(P < 0.01)。在肝脏组织中，Ah组与LPS组的NF-κB mRNA表达量基本一致，但前者表达量相对显著。在脾脏组织中，Ah组在24 h达到峰值，为对照组的2.85倍(P < 0.01);LPS组在96 h达到峰值，为对照组的3.71倍(P < 0.01)。Ah组与LPS组肺脏组织的NF-κB mRNA相对表达量在16 h显著上调，分别为对照组的1.78倍和1.25倍(P < 0.01)。在肾脏组织中，Ah组在8–24 h显著上调，在24 h达到峰值，为对照组的9.29倍(P < 0.01);LPS组在8 h达到峰值，为对照组的3.52倍(P < 0.01)。在皮肤组织中，Ah组在8–24 h显著上调，在24 h达到峰值，为对照组的5.24倍(P < 0.01);LPS组在24-72 h上调，在24 h达到峰值，为对照组的2.64倍(P < 0.01)。在肌肉组织中，NF-κB mRNA相对表达量与IKKα、IKKβ不同，Ah组较LPS组NF-κB mRNA表达量显著上调。Ah组的胃在8-24 h显著上调，且在24 h达到峰值，为对照组的6.59倍(P < 0.01);LPS组在120 h显著上调，为对照组的8.27倍(P < 0.01) (图 9A-H)。
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| 图 9 嗜水气单胞菌和LPS处理后东北林蛙NF-κB mRNA表达量的变化 Fig. 9 The relative expression of NF-κB mRNA in different tissues in Rana dybowskii after infection with Ah and LPS injection. (A) Heart. (B) Liver. (C) Spleen. (D) Lung. (E) Kidney. (F) Skin. (G) Muscle. (H) Stomach, the samples were collected at different time points after Ah or LPS (x-axis). β-actin as an internal control. The results were expressed as the x±s error (bars) of three replicates. *: P < 0.05 vs. LepROT expression on uninfected control group; **: P < 0.01 vs. LepROT expression on uninfected control group. |
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东北林蛙是我国二级保护动物，不仅能大量捕食森林、牧草和农作物的害虫，而且其整体或雌蛙输卵管的干制品，亦称哈士蟆和哈士蟆油，均可入药，是我国名贵中药材之一，具有重要的科研价值和药用价值。研究表明，两栖类易受嗜水气单胞菌感染，是导致种群数目减少的重要原因之一[15]。本研究对东北林蛙LepROT基因的编码区进行了克隆和序列分析，系统进化树分析表明东北林蛙的LepROT与中国林蛙、中华大蟾蜍、非洲爪蟾等具有较高的氨基酸序列同源性，表明LepROT在两栖类分子进化中相对保守。东北林蛙与非洲爪蟾LepROT的三级结构极为相似，推测LepROT在二者体内发挥相同的作用，但前者比后者结构略有松散。本研究还首次分析感染Ah与LPS的东北林蛙各组织中LepROT蛋白表达及NF-κB信号通路中相关因子的表达。结果表明，感染Ah与LPS会导致东北林蛙各组织出现严重病变，LepROT可能通过调节瘦素与瘦素受体结合从而激活NF-κB信号通路。
LepROT是由瘦素受体相关基因编码的跨膜蛋白受体，主要在不同组织间转运瘦素，具有结合游离瘦素和缓冲其血循环浓度水平的功能[11]。在Ah与LPS的刺激下，LepROT基因在东北林蛙大多数组织中明显上调，特别是在脾脏、皮肤和肝脏，这与以往在河豚鱼和黄颡鱼的研究结果一致，表明皮肤是两栖动物抗原呈递的主要部位之一[24-25]。LepROT基因不仅在东北林蛙的不同组织中广泛表达，也在其他物种组织中广泛表达，例如哺乳动物和斑马鱼[10-12]。LepROT信号调控与NF-κB信号通路有关，NF-κB参与调节和诱导多种促炎性细胞因子，包括p65/RelA、p52、c-Rel、RelB、p50以及p52亚单位[26]。NF-κB的激活依赖于其抑制剂IκBα的磷酸化和3个密切相关的激酶(IKKα、IKKβ和IKKγ)，通过与磷酸化相关的丝氨酸残基在IκBα降解中发挥关键作用[27]。在东北林蛙的各个组织中，NF-κB、IKKα和IKKβ基因的表达趋势相似，表明它们之间存在相关性，证实了胁迫后NF-κB信号通路被激活。
瘦素是一种脂肪生成激素，与瘦素受体结合后具有多种生物学功能(如可促进细胞增殖、抗凋亡、促进癌细胞侵袭等)[28]。而在肥胖人群中，瘦素的分泌随着脂肪的增多而浓度增大，但大量的瘦素无法与细胞膜上的受体结合，从而导致瘦素信号通路及其相关生理功能受到抑制，就会出现瘦素抵抗[29]。有报道称，LepROT能抑制细胞膜上LEPR在下丘脑弓状核中的表达，抑制LepROT表达后，可以增强瘦素信号通路表达及相关生理功能的作用，从而缓解瘦素抵抗[30]。在本研究中，我们发现LepROT mRNA的相对表达量在各个组织各个时间点的样品均出现显著上调的现象，这与王传旭[31]的研究结果一致。研究还发现，LepROT与NF-κB、IKKα和IKKβ mRNA的相对表达量均出现上调现象，一些组织出现时间的滞后性，表明LepROT不具有抑制NF-κB、IKKα和IKKβ mRNA的相对表达量上调的作用，其mRNA的表达趋势与NF-κB、IKKα和IKKβ相似。LepROT、NF-κB、IKKα和IKKβ这些基因在东北林蛙中的广泛分布有力地支持了该蛋白可能在两栖类中具有许多不同的生理作用，拓宽了该蛋白在脊椎动物中的功能前景。
4 结论本研究获得了东北林蛙LepROT的核苷酸序列396 bp，编码131个氨基酸残基，其三级结构模型与非洲爪蟾基本相似。东北林蛙LepROT与两栖类、哺乳类等亲缘关系均较近，在不同物种间具有高度保守性。在感染Ah与注射LPS后，其组织中的LepROT、NF-κB、IKKα和IKKβ mRNA均呈现显著上调，推测LepROT可能激活NF-κB信号通路，进一步提高抗感染能力。
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